- Chủng vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh (80oC)
E. ictaluri (-80oC)
Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên BHI (10ml) Ủ 30o C, 48h Ủ 30o C, 24 giờ Vi khuẩn sàn lọc (-80oC)
Cấy ria lên MRSA
Ủ 30o
C, 48h
Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên MRSB (5ml)
Đo OD 600nm, điều chỉnh
về 2x107 tb/ml
Chuyển khối thạch đặt vào giếng đã đục
trên môi trường BHIA đã trải E. ictaluri
Ủ 30o
C, 48h
Trải 50µl dịch vi khuẩn trên môi trường MRSA
Ủ 30o
C, 24h (2 ngày)
Đục lấy khối thạch chứa khuẩn lạc (đường kính 9 mm)
Hình 3.3.4.2.1 Phương pháp đục lỗ thạch.
- Tương tự với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được bảo quản ở -800C, được cấy chuyền và tạo giống cấp 1 trong đĩa thạch máu. Chọn khuẩn lạc để nuôi cấy trong 10ml BHI ,ủ trong 48h để tạo giống cấp 2. Đo OD, điều chỉnh nồng độ vi khuẩn về mật độ vi khuẩn 2×108CFU/ml.
- Dùng 50 µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấp 2 tráng lên môi trường
BHIA. Sau khi tráng đĩa lật úp đĩa và để trong tủ cấy khoảng 15 phút cho khô. Sau đó dùng ống sắt hình trụ (tiệt trùng bằng cách nhúng còn rồi hơ trên lửa nguội thật kỹ) khoan 3 lỗ trên đĩa thạch (đường kính 9mm). Các khối thạch sau khi đục được lấy ra và bỏ đi. Ghi tên kí hiệu các chủng vi khuẩn cần khảo sát lên nắp đĩa.
- Các đĩa tráng vi khuẩn cần khảo sát đã ủ trong 48h trước, trong tủ ấm. chọ những vùng khuẩn lạc mọc dày và đều, dùng ống sắt hình trụ (tiệt trùng bằng cách
SVTH: Trần Trọng Nguyễn 54 MSSV:207111033
nhúng còn rồi hơ trên lửa nguội thật kỹ) khoan 3 khối thạch từ mỗi đĩa (mỗi lần qua chung khác phải tiệt trùng kỹ ống sắt và để nguội).
- Dùng nhíp tiệt trùng, khéo léo gắp các khối thạch và đặt vào các lỗ đã đục
sẵn (tránh đụng đầu nhíp vào mặt thạch đã tráng Edwardsiella ictaluri). 3 khối thạch được đặt vào mỗi đĩa Edwardsiella ictaluri.
- Ủ trong tủ ấm nhiệt độ 28-320C trong 24h, 48h thì xem vòng kháng khuẩn.
Nếu chủng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn có đường kính >17mm được cho là đối kháng mạnh.
3.3.4.3 Phương pháp giếng khuếch tán (Well Diffusion method)
- Dùng 50 µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấp 2 có mật độ vi khuẩn là
2x108CFU/ml để tráng trên đĩa BHIA. Sau khi tráng đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng. Rồi đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng nhíp đã hấp tiệt trùng gấp các khối thạch ra bỏ.
- Dùng 80µl dịch vi khuẩn cần khảo sát, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri, sau đó dán parafilm.
- Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28-300C trong 24h và 48h thì xem xét vòng kháng khuẩn.
SVTH: Trần Trọng Nguyễn 55 MSSV:207111033
Hình 3.3.4.3.1. Phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) Cấy ria lên BA
Đo OD 600nm, điều chỉnh về 2x108 tb/ml
50 µl trải trên BHIA, để khô 15 min và đục lỗ 5 mm (3 lỗ/đĩa) Ủ 24h, 30oC Đo vòng vô khuẩn E. ictaluri (-80oC) Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên BHI (10ml)
Ủ 30oC, 48h
Ủ 30oC, 24h
Vi khuẩn sàn lọc (-80oC)
Cấy ria lên MRSA
Ủ 30oC, 48h Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên MRS (10ml) Đo OD 600nm, điều chỉnh về 2x107 tb/ml (Hút 80 µl nhỏ vào giếng) Ủ 30oC, 48h
SVTH: Trần Trọng Nguyễn 56 MSSV:207111033
3.3.4.4 Phương pháp đĩa giấy
Hình 3.3.4.4.1 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc-paper diffusion method)
- Dùng 50 µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấp 2 có mật độ vi khuẩn là
2x108CFU/ml để tráng trên đĩa BHIA. Sau khi tráng đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô.
- Dùng 1000 µl cho vào eppendorf đem ly tâm 10000 vòng/10 phút. Thu dịch nổi cho vào eppendorf khác, loại bỏ sinh khối.
- Đặt vào dịch nổi mỗi chủng vi khuẩn 3 đĩa giấy, ngâm trong 15 phút cho các vi khuẩn thấm vào đĩa giấy.
(đặt trên môi trường thạch đã trải Ed.)
Vi khuẩn đã sàng lọc (-80oC)
Cấy ria lên BHIA
Ủ 30oC, 48h
Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên BHI (5ml)
Ủ 30oC, 48h
Ngâm paper disc vào dịch treo (15min)
E. ictaluri (-80oC)
Cấy ria lên BA
Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên BHI (10ml)
50 µl trải trên BHIA để khô 15 min
Ủ 24h, 48h, 30oC Đo vòng vô khuẩn
Ủ 30oC, 48h
Ủ 30oC, 24h
Ly tâm 13.000rpm, 10 phút, lấy dịch treo
SVTH: Trần Trọng Nguyễn 57 MSSV:207111033
- Sau đó dùng nhíp gắp các đĩa giấy ra và đặt lên 3 vị trí khác nhau của mỗi đĩa đả
tráng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri . Để cho vi khuẩn khô trong vòng 15 phút,dán
parafilm lại và ủ trong tủ lạnh khảo sát vòng kháng khuẩn ở 24h và 48h. 3.3.5 Phương pháp nhuộm Gram và mô tả hình thái
a. Phân biệt Gram
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm Gram dương và Gram âm dựa trên các đặc tính hóa lý của thành tế bào.
Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dầy, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thế _iot. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thừng có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài.
Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iot bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu. Khử màu là bước quan trọng và cần kĩ năng nhất định vì khả năng bắt màu Gram dương không phải là "tất cả hoặc không."
b. Vật liệu nhuộm Gram - Crystal viole
- Lugo
- Alcohol 95% - Safranine
SVTH: Trần Trọng Nguyễn 58 MSSV:207111033
c. Cách tiến hành:
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lây một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí
Cố định tế bào: Hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 2 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ dịch tẩy màu, giử khoảng 30 giây ( cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
- Soi kính : dùng vật kính dầu 100x
3.4 Xử lý số liệu
Sử dụng phần mền SPSS 13.00 for Window số liệu thống kê các giá trị trung bình. Sử dụng phép kiểm định t đối với hai mẫu độc lập (Independent – Sample T Test) để so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm với p < 0,05.
SVTH: Trần Trọng Nguyễn 59 MSSV:207111033