Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.2. Ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna đời F
Những D. magna con 24h tuổi của bố trí thí nghiệm trên được chúng tôi chọn để
bố trí thí nghiệm tiếp theo với các chất gây rối loạn nội tiết và các nồng độ như trên bảng 4.1 và 4.2
4.2.1. Tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí thí nghiệm
Bảng 4.13: Bảng tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí
17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol
COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5
% D. magna
sống sót
83,6 73,3 87,5 20 30 85 85 80 20 15 7,5
Sau 21 ngày bố trí chúng tôi nhận thấy tỷ lệD. magna mẹ sống sót trong môi
trường COMBO là cao nhất 83,6% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol và 85% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol.
Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 3
(50µg/l) và thứ 4 (100 µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót thấp nhất là 20% và 30%.Ở nồng độ thứ 2 (10µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 87,5%. Như vậy chứng tỏ ở nồng độ 17α-Ethynylestradiol càng thấp lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối
chứng.
Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 5
SVTH: Nguyễn Duy Tân 45
(10µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 85% và 80%. Như vậy chứng tỏ ở nồng độ 17β-Estradiol thấp thì lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối chứng.
4.2.2. Số lượng D. magna được sinh ra trên 1 D. magna mẹ sau 21 ngày bố trí thí
nghiệm
Bảng 4.14: Số lượng D. magna con được sinh ra trên 1 D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí
17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Số lượng D.magna con 44 43,9 33,9 23,2 36,3 38 37 37,8 53,5 27,9 50,3
Kết quả thử nghiệm ở bảng 4.14 cho thấy:
Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí
nghiệm với 17α-Ethynylestradiol ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) tương đương với môi trường COMBO. Sự ức chế sinh sản xảy ra từ nồng độ thứ 2 (10µg/l) đến nồng độ thứ 4 (100µg/l).
Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí
nghiệm với 17β-Estradiol ở các nồng độ thứ 1 (1µg/l) và thứ 2 (10µg/l) tương đương với
môi trường COMBO.Ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) số lượng D. magna con trên D. magna mẹ là thấp nhất 27,9, ở hai nồng độ thứ 3 (50µg/l) và thứ 5 (200µg/l) thì số lượng D.
magna con trên D. magna mẹ là cao nhất.
Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy 17β-Estradiol có thể có khả năng kích thích sinh sản ở nồng độ thứ 3 (50µg/l).
SVTH: Nguyễn Duy Tân 46
Tuy nhiên do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chưa kịp kiểm chứng lại.
4.2.3. Sự phát triển bất thường của D. magna
Bảng 4.15: Tổng số trứng cyst của D. magna mẹ tạo ra
17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Số trứng cyst 13 7 5 23 2 11 3 9 0 17 5
Sau khi thực hiện thí nghiệm chúng tôi nhận thấy:
Đối với chất 17α-Ethynylestradiol ở tất cả các nồng độ đều có xuất hiện trứng cyst, riêng ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) sự xuất hiện trứng cyst là cao nhất 46% và ở nồng độ 4 (100 µg/l) sự xuất hiện trứng cyst là thấp nhất 4%.Tương ứng với sự tạo trứng cyst
chúng tôi cũng nhận thấy số lượng của D. magna con ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) thấp.
Đối với chất 17β-Estradiol ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) không có sự xuất hiện của trứng cyst, trứng cyst xuất hiện nhiều nhất ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) chiếm 37,7% và ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) trứng cyst là thấp nhất 6,6%. Tương ứng với sự tạo trứng cyst
chúng tôi cũng nhận thấy số lượng của D. magna con ở nồng độ thứ 4 (100µg/l ) thấp.
Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy ở môi trường dùng làm đối chứng COMBO cho trứng cyst cao nhất có thể là do điều kiện nhiệt độ bị thay đổi, tuy nhiên khi ở nồng độ 1µg/l của 17α-Ethynylestradiol và của 17β-Estradiol đã hạn chế được sự tạo thành trứng cyst khi điều kiện nhiệt độ bất lợi.
SVTH: Nguyễn Duy Tân 47
4.2.4. Ảnh hưởng gây chết
Với hai chất là 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol, chúng tôi nhận thấy với các nồng độ trên chúng bất động sau 48h, sau 6 ngày và sau 21 ngày là:
4.2.4.1. Sau 48 giờ Bảng 4.16: Bảng tỷ lệ % D. magna bất động sau 48h 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 6,6 11,6 10 80 58,3 1,6 8,3 5 20 82,5 80
Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 48h tỷ lệ D. magna bất động trong môi
trường COMBO là thấp nhất 6,6% và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở nồng độ thứ 3
(50µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 80%.
Đối với chất 17β-Estradiol sau 48h tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 1,6%, và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở hai nồng độ thứ 4 (100µg/l) và thứ 5 (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 82,5% và 80%.
4.2.4.2. Sau 6 ngày
Bảng 4.17: Bảng tỷ lệ % D. magna bất động sau 6 ngày
17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol
Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5
% D. magna
bất động
SVTH: Nguyễn Duy Tân 48
Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 6 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi
trường COMBO là thấp nhất 6,6% và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở nồng độ thứ 3
(50µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 80%.
Đối với chất 17β-Estradiol sau 6 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 6,6%, và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở hai nồng độ thứ 4 (100µg/l) và thứ 5 (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 82,5% và 85%
4.2.4.3. Sau 21 ngày
Bảng 4.18: Bảng tỷ lệ % D. magna bất động sau 21 ngày
17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMB O β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 16,6 28,3 12,5 80 70 15 15 20 80 85 92,5
Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 21 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi
trường COMBO là 16,6% và tỷ lệ này thấp nhất ở nồng độ thứ 2 (10µg/l), ở nồng độ thứ
3 (50µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 80%.
Đối với chất 17β-Estradiol sau 21 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường
COMBO và nồng độ thứ 1 (1µg/l) đều bằng nhau bằng15%, và tỷ lệ này tăng dần theo
nồng độ, ở nồng độ thứ 5 (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 92,5% . 4.2.5. Ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên thời gian phát triển của D.
magna
SVTH: Nguyễn Duy Tân 49
Bảng 4.19: Thời gian D. magna bắt đầu sinh sản trong môi trường 17α-Ethynylestradiol
COMBO α1 α2 α3 α4 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 Ngày sinh sản 8 8 8 8 8 7 8 8 14 17 17 11 15 15
Dựa vào bảng 4.19 ta thấy trong môi trường COMBO và nồng độ thứ 1 (1µg/l),
thứ 2 (10µg/l) D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 8. Ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) thứ 4 (100µg/l) có sự ức chế sinh sản, sự ức chế này cao nhất ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) bắt đầu sinh sản từ ngày 14 đến ngày 17 vì vậy số lượng D. magna con được sinh ra ở nồng độ
này thấp.
4.2.5.2. Chất 17β-Estradiol
Bảng 4.20: Thời gian D. magna bắt đầu sinh sản trong môi trường 17β-Estradiol
COMBO β1 β2 β3 β4 β5 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 Ngày sinh sản 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 12 11 12 10
Dựa vào bảng 4.20 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ 3 (50µg/l)
không có sự ức chế sinh sản D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 7-8, ở hai nồng độ còn lại có sự ức chế sinh sản D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 10-12.
SVTH: Nguyễn Duy Tân 50
4.2.6. Sự đáp ứng về dòng đời của D. magna với chất gây rối loạn nội tiết
4.2.6.1. Chất 17α-Ethynylestradiol
Bảng 4.21: Thời gian D. magna tồn tại trong môi trường 17α-Ethynylestradiol
COMBO α1 α2 α3 α4
0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3
Ngày chết
58 60 60 59 60 56 58 66 41 42 34 53 49 45
Dựa vào bảng 4.21 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ 2 (10µg/l) thời
gian sống sót của D. magna không có sự khác biệt đáng kể từ 56-66 ngày. Thời gian sống sót của D. magna giảm dần ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) và thứ 4 (100µg/l) nên có sự ảnh hưởng đến số lượng D. magna con được sinh ra.
4.2.6.2. Chất 17β-Estradiol
Bảng 4.22: Thời gian D. magna tồn tại trong môi trường 17β-Estradiol
COMBO β1 β2 β3 β4 β5
0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2
Ngày chết
64 65 64 65 63 65 62 60 61 44 55 42 29 28 25
Dựa vào bảng 4.22 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ 2 (10µg/l) thời
gian sống sót của D. magna không có sự khác biệt đáng kể từ 60-65 ngày.Thời gian sống
sót giảm dần từ nồng độ thứ 3 (50µg/l) đến thứ 5 (200µg/l) và đạt thấp nhất ở nồng độ
SVTH: Nguyễn Duy Tân 51
4.3. Khảo sát hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết trên kênh rạch Thành Phố Hồ Chí Minh
Tại phòng CNBĐSH chúng tôi đã lấy mẫu ở một số vị trí trên kênh rạch Tp. Hồ Chí Minh và phân tích hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết.
4.3.1. Xác định vị trí lấy mẫu
Mẫu được thu tại 7 vị trí trên các kênh rạch ở Tp Hồ Chí Minh, chúng tôi bố trí sơ đồ lấy mẫu sao cho trong 7 vị trí lấy mẫu phải có những vị trí nước bị ô nhiễm nặng như các vị trí tại cầu Tham Lương, cầu tạm Chữ Y, cầu Thị Nghè…và một số vị trí nước khá sạch như cầu Sài Gòn, cầu Đồng Nai…Vị trí lấy mẫu được xác định bằng GPS (máy định vị toàn cầu).Thu mẫu vào lúc nước đạt mức thủy triều cao nhất trong ngày theo lịch thủy triều.
Bảng 4.23: vị trí thu mẫu
Vị trí
STT Địa điểm Ký hiệu mẫu
Kinh độ Vĩ độ 01 02 03 04 05 06 07
Cầu Tham Lương Cầu tạm Chữ Y Cầu Chữ Y Cầu Kênh Tẻ Cầu Thị Nghè Cầu Sài Gòn Cầu Đồng Nai KR1 KR2 KR3 KR4 KR5 KR6 KR7 10049’41.9”N 10045’02.2”N 10044’47.7”N 10045’41.9”N 10047’28.5”N 10047’53.1”N 10054’21.4”N 106046’09.6”E 106041’00.3”E 106040’35.8”E 106042’06.7”E 106054’22.7”E 106043’44.1”E 106050’28.8”E
SVTH: Nguyễn Duy Tân 52
4.3.2. Kết quả phân tích nồng độ chất gây rối loạn nội tiết
Các mẫu nước sau khi được thu và vận chuyển về phòng thí nghiệm đã được phân tích xác định hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết (EDs) bằng phương pháp YES(ThS.Lê Thị Ánh Hồng, [phụ lục 1]) với nấm men đã được chuyển gen Estrogen Receptor. Chất chuẩn là 17β-Estradiol do đó số liệu thu được là nồng độ chất gây rối loạn nội tiết tương đương nồng độ 17β-Estradiol (ng/l).
Bảng 4.24: Kết quả phân tích nồng độ (ng/l) chất gây rối loạn nội tiết
Số lần lấy mẫu Địa điểm lấy mẫu
01 02 03 KR1 6.207 1.169 0.895 KR2 2.878 0.635 0.800 KR3 2.718 0.550 0.610 KR4 1.031 0.515 0.929 KR5 2.678 0.442 0.29 KR6 2.991 0.332 0.167 KR7 1.573 0.113 0.068
Do ảnh hưởng của thủy triều và lượng nước mưa nên các lần phân tích EDs trong mẫu khác nhau rất lớn như ở vị trí KR1 lần 1 là 6,207 ng/l và lần 3 là 0,895 ng/l
Mẫu ở vị trí cầu Tham Lương là có hàm lượng EDs cao nhất 6,207ng/l trong tất cả các mẫu phân tích
SVTH: Nguyễn Duy Tân 53
Xếp theo thứ tự nồng độ EDs từ cao tới thấp thì chúng tôi nhận thấy như sau: KR1 > KR6 > KR2 > KR3 > KR5 > KR7 > KR4
Theo như báo cáo của Univeritat Bremen [14 ] thì: Đối với 17β-Estradiol :
- 8.0µM_21 ngày không ảnh hưởng đến đời sống, không ảnh hưởng đến quá trình sinh sản, không ảnh hưởng đến sự phát triển của F1
- 270µg/l không ảnh hưởng đến giới tính, sinh sản - LC50 2,97mg/l 48h_giảm sinh sản
- 1_100µg/l 6 ngày không ảnh hưởng đến giới tính, sinh sản Đối với 17α-Ethynylestradiol :
- 100ppb – 5ppm giảm sinh sản, không ảnh hưởng đến râu và giới tính
Vậy với nồng độ EDs phân tích được ở các mẫu nước phân tích từ 6,207 – 1,573 ng/l trên kênh rạch Tp Hồ Chí Minh không gây ảnh hưởng đến Daphnia sp.Tuy nhiên có thể ảnh hưởng đến những loài có kích thước nhỏ hơn như Ceriodaphnia sp. hay Brachionus sp.
SVTH: Nguyễn Duy Tân 54
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. Kết luận
Sau 3 tháng thực hiện đề tài “ khảo sát sự ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna ’’ chúng tôi thu được kết quả :
Ảnh hưởng của 17α-Ethynylestradiol
Tỷ lệ sống sót của Daphnia magna bố trí thí nghiệm thấp hơn so với đối chứng. Ở nồng độ 100µg/l 17α-Ethynylestradiol sau 48h số lượng Daphnia magna
chết đến 81,7%.
Thời gian sinh sản là 7 ngày với nồng độ 17α-Ethynylestradiol 1µg/l và 15 ngày với nồng độ 17α-Ethynylestradiol 50µg/l.
Vòng đời của Daphnia magna bị rút ngắn xuống còn 40 ngày so với đối chứng là 61 ngày.
Tỷ lệ sinh sản cao ở nồng độ 100µg/l là 54,4 D. magna con trên D. magna mẹ so với đối chứng là 25,4 D. magna con trên D. magna mẹ.
Ảnh hưởng của17β-Estradiol
Tỷ lệ sống sót của Daphnia magna bố trí thí nghiệm thấp hơn so với đối chứng. Ở nồng độ 100µg/l 17β-Estradiol sau 48h số lượng Daphnia magna chết đến
SVTH: Nguyễn Duy Tân 55
Thời gian sinh sản là 8 ngày với nồng độ 17β-Estradiol 1µg/l, 10µg/l và 15 ngày với nồng độ 17β-Estradiol 100µg/l.
Vòng đời của Daphnia magna bị rút ngắn xuống còn 43 ngày so với đối chứng là 67 ngày.
Tỷ lệ sinh sản cao ở nồng độ 50µg/l là 64,7 D. magna con trên D. magna mẹ so với đối chứng là 32,7 D. magna con trên D. magna mẹ.
Khi bố trí tiếp theo của Daphnia magna đời F1 cũng cho kết quả tương tự như ở Daphnia magna mẹ
5.2. Kiến nghị
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chưa thực hiện hết các yêu cầu của đề tài. Do vậy chúng tôi có những kiến nghị như sau:
Bố trí thêm 3 hoặc 4 lần thí nghiệm để đưa được vào phần mềm thống kê, xếp hạng để được kết quả chính xác (do bố trí trên sinh vật nên có sai số rất lớn).
Thử nghiệm trực tiếp Daphnia magna đối với các nguồn nước ô nhiễm để đánh giá nguy cơ ảnh hưởng của nguồn nước đó đến động vật thủy sinh.
Khảo sát ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên các loài thủy sinh hiện diện nhiều ở Việt Nam như: Ceriodaphnia cornuta, Brachionus calyciflorus,…
Vì nồng độ của EDs tồn tại trong nước rất thấp do đó cần phải tiến hành chiết mẫu. Quá trình chiết mẫu thực hiện bằng phương pháp tách chiết pha rắn SPE (Solid Phase Extraction).
Hiện nay chưa có một phương pháp phân tích chuẩn nào được công bố rộng rãi trên thế giới đối với EDs. Việc phân tích cảng trở nên khó khăn khi EDs trong môi trường phân tích tồn tại với nồng độ rất thấp và nguồn phát sinh cũng rất phức tạp, thành phần cũng rất đa dạng (có khoảng 85000 chất cần được kiểm tra). Tuy nhiên về nguyên tắc, EDs cũng được phân tích theo một sơ đồ chung như các hợp chất hữu cơ khác.
Lọc
Đưa mẫu vào nhiệt độ phòng, lấy 500ml mẫu và cho vào 2,5ml Methanol trước khi lọc
Lọc mẫu qua bong gòn, giấy lọc 0,8µm và 0,2µm, bình lọc, máy hút chân không
Chiết mẫu
Cột SPE Strata X (5ml) hoạt hóa bằng 8 ml Methanol, sau đó là 8ml Methanol/nước tỉ lệ 95:5. Chiết 500ml mẫu qua cột SPE với tốc độ 5ml/phút, sau khi chiết rửa mẫu bằng 5ml Methanol/nước tỉ lệ 1;1. Làm khô cột SPE bằng cách bơm khí nitơ qua cột, gói bằng giấy bạc và bảo quản ở 40C.
Tách rửa và cô đặc
Tách rửa với 7ml Methanol, cô đặc ở 400C trong tủ hút chân không, hòa tan lại trong 500µl Methanol và lưu trong chai lọ nhỏ 1,5ml, bảo quản ở 40C.
Đưa mẫu về nhiệt độ phòng, lắc đều mẫu sau đó đong 500ml mẫu vào bình cầu