Nguyên tắc: Dùng ‘casein’ làm cơ chất, xác định khả năng phân giải
protein của enzym protease trên cơ sở đo vòng phân giải sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử xanh methylen.
Cách tiến hành: Chuẩn bị 6 đĩa petri, cân casein 1,0g, thạch 2,0g cho vào cốc có mỏ 200ml, thêm nước cất vừa đủ 100ml, khuấy đều, thêm 10 giọt xanh methylen, khuấy đều. Đun nóng trong lò vi sóng khoảng 3 phút để casein và thạch tan hết. Đổ 20ml dung dịch trên vào các đĩa thạch. Khi thạch đông thì đục thạch đường kính 0.6 cm, nhỏ lần lượt 0,05ml dịch lên men nuôi cấy cho trong tủ ẩm 370C khoảng 24 giờ. Đem đo đường kính vòng phân giải, tính lượng trung bình.
A
B B
Hình 2.1. Mẫu đĩa petri 2.3.5 Phương pháp thử hoạt tính amylase
Nguyên tắc: Theo phương pháp Wolhgemuth, phương pháp này xác định lượng enzym ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột với chất chỉ thị màu iodin.[quyền vàng ]
Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzym ít nhất mà sau 30 phút ở 300C, khi có ion clorine có thể phân giải 1mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với iodine. Hoạt tính của enzym được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên 1ml dịch môi trường hoặc 1ml dung dịch chiết enzym.
Cách tiến hành:
- Thử hoạt tính trên đĩa petri: Làm tương tự như xác định protease đã kể ở trên, thay casein bằng tinh bột.
- Thử hoạt tính trên ống nghiệm: Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 10ml dung dịch tinh bột 1%, đặt vào máy điều nhiệt có nhiệt độ 300C trong thời gian 10 phút để đưa nhiệt độ của dung dịch tới 300C. Bổ sung vào ống nghiệm thứ nhất 5ml nước cất (ống nghiệm chứng), ống thứ hai 5ml amylase (mẫu chuẩn), vào ống thứ ba 5ml dịch lên men (ống thí nghiệm), khuấy đều nhanh hỗn hợp và giữ nghuyên ở nhiệt độ này trong thời gian 10 phút. Lấy từ ba ống nghiệm trên mỗi ống 0,5ml hỗn hợp phản ứng cho vào ba ống nghiệm khác đã có sẵn 50ml dung dịch iod 0,1N đã pha loãng 50 lần, lắc đều hỗn hợp trong bình [ quyền vàng]. Các dung dịch nhận được có màu như sau:
+ Dung dịch kiểm chứng có màu xanh + Dung dịch chuẩn không màu
+ Dung dịch thí nghiệm có màu xanh tím nhạt với cường độ màu khác tùy thuộc lượng tinh bột chưa bị thủy phân.
