Việc bám vào enzyme có thể làm biến dạng các cơ chất. Trung tâm hoạt động của enzyme có thể phù hợp với chất trung gian ở trạng thái chuyển tiếp tốt hơn cơ chất. Một khi cơ chất bám vào enzyme, nó sẽ bị ép thành hình dạng của chất phản ứng trung gian. Hình dạng đã bị biến đổi của
cơ chất khó được chứng minh vì áp lực chỉ được tạo ra sau khi cơ chất liên kết với enzyme.
Tốc độ phản ứng của enzyme
Các nguyên tắc của động lực học hóa học áp dụng cho các phản ứng enzyme, với những thay đổi nhất định. Thông thường, tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ các chất phản ứng. Đối với các enzyme, tỷ lệ này là tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất [S], chỉ ở nồng độ cơ chất thấp. Ở nồng độ cơ chất cao hơn, tất cả các vị trí hoạt động của các enzyme sẽ được lấp đầy bởi cơ chất và các enzyme không thể làm việc nhanh hơn. Enzyme đã được bão hòa cơ chất và đã đạt đến vận tốc tối đa của nó,Vmax hoặc Vm. Kết quả mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất [S] và tốc độ phản ứng là một đường cong hyperbol (Hình 7.34).
Vmax phụ thuộc vào bản chất của các phản ứng hóa học và do đó phụ thuộc vào các đặc điểm của cơ chất và vị trí hoạt động enzyme. Vmax có thể thay đổi tùy vào pH và nhiệt độ. Càng nhiều enzyme hơn, càng nhiều các cơ chất hơn có thể xử lý đồng thời, do vậy Vmax tỷ lệ thuận với lượng enzyme. Km, hoặc hằng số Michaelis, là nồng độ cơ chất cho phép đạt một nửa vận tốc tối đa. Nó chủ yếu phụ thuộc vào ái lực của các cơ chất và vị trí hoạt động của enzyme và không phụ thuộc vào nồng độ của enzyme. Km càng thấp, ái lực của cơ chất và enzyme càng cao và phản ứng càng nhanh hơn (- ở nồng độ cơ chất thấp, ở nồng độ cơ chất cao, Km đều trở nên không thích hợp). Các yếu tố này được tóm tắt trong phương trình Michaelis - Menten:
Những chất tương tự (đồng hình-analog) như cơ chất ức chế hoạt động của enzyme tại trung tâm hoạt động
Các chất đồng hình là các phân tử đủ giống như cơ chất để có thể gắn vào trung
tâm hoạt động của enzyme. Một vài chất đồng hình hoạt động như những cơ chất thay thế cho các enzyme. Một số chất đồng hình khác liên kết với trung tâm hoạt động, nhưng thay vì phản ứng thì nó lại ức chế trung tâm hoạt động và ức chế enzyme. Các chất như vậy gọi là chất ức chế cạnh tranh, vì chúng cạnh tranh với cơ chất trong
việc liên kết với enzyme. Mức độ ức chế phụ thuộc vào nồng độ và ái lực giữa chất ức chế, cơ chất với enzyme.
Nhiều (thậm chí hầu hết) trung tâm hoạt động của các enzyme được thiết kế để phù hợp tốt hơn với chất phản ứng trung gian hoặc trạng thái chuyển tiếp, chứ không phải là với cơ chất của nó. Thiết kế này có xu hướng làm biến dạng các cơ chất theo hướng yêu cầu của phản ứng và giúp phản ứng diễn ra. Do đó, một số các chất ức chế cạnh tranh là các phân tử bắt chước cấu trúc của chất phản ứng trung gian. Được gọi là “dạng đồng hình với trạng thái chuyển tiếp - transition state analog.” Proline racemase chuyển đổi đồng phân D và L của proline bằng cách loại bỏ một phân tử H và thay bằng cấu hình khác (Hình 7.35). Các cơ chất và sản phẩm đều là tứ diện tâm carbon nhưng phân tử chuyển tiếp lại dạng phẳng. Chất ức chế cạnh tranh tốt nhất là các hợp chất vòng phẳng chứ không phải là hợp chất có cấu hình tứ diện giống cơ chất ( hình 7.35).
Các enzyme β-galactosidase chia tách nhiều phân tử trong đó galactose được liên kết với phân tử khác (xem hình 7.27, ở trên). Để tận dụng đặc điểm này, các nhà nghiên cứu có thể sử dụng một chất gọi là ONPG (ortho-nitrophenyl galactoside), trong đó bao gồm orthonitrophenol liên kết với galactose. Khi ONPG bị chia cắt tạo thành galactose là không màu và ortho-nitrophenol, có màu vàng (Hình 7.36). Sử dụng ONPG cho phép các nhà nghiên cứu biết được lượng β -galactosidase bằng cách đo sự xuất hiện của màu vàng. Tương tự như vậy, X-gal được phân cắt bởi β-galactosidase thành một chất nhuộm màu xanh cộng với galactose (Xem Ch. 25 cho các ứng dụng.). Các hợp chất không màu (hoặc nhạt), nhưng khi phản ứng tạo thành sản phẩm có màu mạnh gọi là các cơ chất tạo màu (chromogenic substrate)
Sự ức chế không thuận nghịch (Irreversible inhibition) xảy ra khi chất ức chế liên kết cộng hóa trị với và làm thay đổi một enzyme, thường tại trung tâm hoạt động. Chất ức chế cộng hóa trị không phải luôn luôn là các chất đồng hình. Một số chất ức chế không thuận nghịch phản ứng với các thành phần của trung tâm hoạt động, các chất ức chế khác phản ứng với các vùng khác của protein và có thể ảnh hưởng đến hình dạng, độ hòa tan hoặc các đặc tính khác của protein. Ví dụ, chất độc thần kinh, sarin, được sử dụng trong chiến tranh hóa học là chất ức chế cộng hóa trị enzym có serine trong trung tâm đang hoạt động (Hình 7,37). Chất độc thần kinh này phản ứng với các serine và khóa các trung tâm hoạt động vĩnh viễn, làm cho enzyme không hoạt động được. Nhiều enzyme thủy phân, bao gồm các protease, dựa vào gốc serine hoạt động. Cũng vậy, Esterase acetylcholine, enzyme phân cắt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine. Sự ức chế enzyme này gây ra tình trạng tê liệt của các mối nối thần kinh cơ và cuối cùng tử vong do suy hô hấp.
Enzyme có thể được điều hòa trực tiếp
Các hoạt động của một loại enzyme hoặc protein khác có thể được kiểm soát ở mức độ gene thông qua việc quyết định tổng hợp protein đó hay không. Sự điều hòa ở cấp độ gene như vậy sẽ được thảo luận trong chương sau. Đáp ứng ở cấp độ tế bào có thể nhanh chóng hơn nếu hoạt động của protein có sẵn được kiểm soát. Mặc dù hầu hết các ví dụ sau đây áp dụng cho các enzyme, tất cả các loại protein, bao gồm protein điều hòa, protein vận chuyển và các protein cơ học, đều có thể được biến đổi tương tự và được điều hòa hoạt động.
Tốc độ mà phần lớn các enzyme làm việc chỉ đơn giản phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và lượng enzyme có mặt. Lượng enzyme lại phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của gen mã hóa enzyme đó. Tuy nhiên, một tỷ lệ đáng kể các enzyme cũng được trực tiếp điều hòa theo nhiều cách khác nhau. Điều này có ưu điểm là nó ít nhiều tức thời. Điều hòa như vậy thường là thuận nghịch. Vì vậy mà một loại enzyme có thể tạm thời không hoạt động mà không bị phân hủy, nhưng có thể được được sử dụng lại sau này nếu cần thiết.
Enzyme được điều hòa thường được tìm thấy ở bước đầu, bước kết thúc hoặc bước rẽ nhánh của con đường trao đổi chất. Kiểm soát được gây ra tại những điểm quan trọng và các enzyme ở giữa là tự hoạt động. Nhiều con đường tổng hợp sinh học được quy định bởi cơ chế điều hòa ngược (negative feedback) (Hình 7.38). Các sản phẩm cuối cùng của con đường chuyển hóa ức chế enzyme xúc tác phản ứng đầu tiên trong con đường đó. Bằng cách này khi sản phẩm đã đủ, tế bào không lãng phí vật liệu tổng hợp enzyme nữa.
Nhiều con đường tổng hợp sinh học được phân nhánh và dẫn đến việc tạo ra một số sản phẩm cuối cùng. Trong trường hợp này, các enzym ở mỗi điểm đầu nhánh có thể được kiểm soát bởi các sản phẩm của các nhánh riêng biệ tương ứng. Một ví dụ là sự tổng hợp của các amino acid họ aspartate. Aspartate là tiền chất của bốn amino acid khác (Lys, Met, Thr, và Ile), và tất cả các amino acid đều có sự ức chế ngược tại đầu nhánh hoặc đầu con đường chuyển hóa lớn.
Enzyme dị lập thể bị ảnh hưởng bởi phân tử tín hiệu
Enzyme này được điều chỉnh thông qua việc bám vào của các phân tử nhỏ, ở 1 vị trí cách xa trung tâm hoạt động, chuyển đổi qua lại giữa hai cấu hình 3-D khác nhau và được gọi là enzyme dị lập thể. Sự chuyển đổi giữa hai dạng hoạt động và không hoạt động liên quan đến sự thay đổi hình dạng và sự lắp ráp hoặc tháo rời của các tiểu phần protein tạo nên enzyme. Ở dạng hoạt động, vị trí hoạt động luôn sẵng sàng gắn cơ chất, trong khi ở dạng không hoạt động, trung tâm hoạt động thường bị khóa hoặc bị thay đổi hình dạng làm cho các cơ chất không thể liên kết. Các phân tử nhỏ điều hoà enzyme liên kết tại ở vị trí đặc hiệu gọi là vị trí dị lập thể vì khi chúng chiếm vị trí đó gây nên sự thay đổi hình dạng của các enzyme (Hình 7.40).
Enzyme dị lập thể thường không tuân theo động học enzyme chuẩn Michaelis- Menten. Đồ thị biểu thị tốc phản ứng và nồng độ của cơ chất là hình chữ S hoặc hình xich ma, không phải hình hypebol. Thay đổi dị lập thể có thể làm thay đổi Km hoặc các Vm hoặc cả hai. Các chất điều hòa dị lập thể thường không liên quan đến cấu trúc hóa học của cơ chất enzyme mà chúng kiểm soát. Như đã nói ở trên, chúng thường là những sản phẩm cuối cùng của con đường trao đổi chất mà enzyme tham gia.
Enzyme dị lập thể có thể được điều hòa âm hoặc dương hoặc cả hai. Ví dụ, các enzyme phosphofructokinase (PFK) là điểm kiểm soát quan trọng của quá trình đường phân. Khi có rất nhiều ATP, ATP ức chế PFK, trong khi đó lượng tích lũy AMP và/ hoặc ADP cao sẽ đánh tín hiệu tế bào đang ở mức thấp về năng lượng và kích hoạt PFK. Vì vậy, một số enzyme dị lập thể có hai vị trí điều hòa dị lập thể khác nhau, một cho chất hoạt hóa và một cho chất ức chế. Trong trường hợp của PFK, ATP là chất điều hòa dị lập thể âm và AMP chất điều hòa dị lập thể dương.
Tất cả các enzyme dị lập thể bao gồm nhiều tiểu phần. Khi chất điều hòa dị lập thể bám vào, nó thay đổi hình dạng của tiểu phần mà nó kết hợp lên. Trong một số trường hợp, điều này cũng ảnh hưởng đến sự lắp ráp của các tiểu phần (Hình 7.41). Một dạng tồn tại của các protein dị thể là monomer và dạng khác là multimer. Trong trường hợp khác, các tiểu đơn vị gắn vào với nhau. Trong trường hợp này, sự thay đổi hình dạng có thể được truyền từ một tiểu phần đến tiểu phần kế tiếp (tiểu phần này bây giờ có thể liên kết phân tử điều hòa dị lập thể dễ dàng hơn). Các tiểu phần như vậy được mô tả diễn ra sự phối hợp thay đổi hình dạng (concerted shape change).
Nhiều protein bám DNA cũng là protein dị lập thể. Chúng thay đổi hình dạng cũng như khả năng liên kết của chúng với DNA khi các phân tử điều hòa nhỏ gắn với chúng. Điều này cho phép điều hòa sự biểu hiện của gene để đáp ứng một loạt các kích thích hóa học, như sẽ được thảo luận trong các chương 9 và 10.
Enzymes có thể được kiểm soát bởi những biến đổi hóa học
Một vài protein thay đổi cấu hình và hoạt động sau khi liên kết với một phân tử nhỏ. Trong trường hợp khác, hình dạng thay đổi là do sự thay đổi về mặt hóa học của protein. Bình thường điều này xảy ra khi một nhóm chất được thêm vào và nó có thể được gỡ bỏ ra được sau đó. Nhóm phosphate là ví dụ điển hình của các phân tử nhỏ có ảnh hưởng đến sự thay đổi hình dạng, nhưng các nhóm khác bao gồm acetyl, methyl, và adenyl (AMP) có thể cũng có hiệu quả. Nhóm phosphate được gắn vào protein bởi các enzyme được gọi là protein kinase và bị loại bỏ bởi các protein phosphatase (Hình 7.42). Việc điều hòa hoạt động của enzyme bằng thay đổi liên kết cộng hoá trị của nó là tương đối hiếm ở vi khuẩn nhưng cực kì phổ biến ở động vật. Khoảng một phần ba của tất cả 10.000 protein khác nhau hoặc nhiều hơn trong một tế bào động vật được phosphoryl hóa tại bất cứ thời điểm nào. Khi nhận được tín hiệu từ bên ngoài, chúng thường phản ứng lại bằng cách phosphoryl hóa một tập hợp các protein bao gồm cả enzyme và các yếu tố phiên mã.
Ví dụ cổ điển về sự điều khiển thông qua quá trình phosphoryl hóa là sự tổng hợp và phân giải glycogen ở tế bào động vật. Glycogen là một carbohydrate dự trữ bị phân cắt ra để tạo thành glucose khi tế bào cần năng lượng. Nó được tổng hợp bởi glycogen synthase và bị phân hủy bởi glycogen phosphorylase (hình 7.43). Cả hai đều được kiểm soát bởi các enzyme phosphoryl hóa. Glycogen phosphorylase được kích hoạt khi phosphoryl hóa, trong khi đó glycogen synthase bất hoạt khi bị phosphoryl hóa. Thông thường, có một chuỗi các phản ứng enzyme liên quan đến hai protein kinase. Khi các tế bào cần năng lượng, protein kinase A phosphoryl hóa cả glycogen synthase và phosphorylase kinase, enzyme sẽ đến lượt phosphoryl hóa glycogen phosphorylase.
Một số enzyme được hoạt hóa bởi sự cắt bớt phân tử tiền chất protein để nhường tạo ra enzyme hoạt động. Các enzyme tiêu hóa trypsin, chymotrypsin và pepsin được tổng hợp ở dạng tiền chất như là trypsinogen, chymotrypsinogen và pepsinogen. Chỉ trong ruột, an toàn các bên ngoài tế bào sinh ra chúng, chúng được kích hoạt bằng sự tách ra của một chuỗi polypeptide. Không giống như sự điều hòa bằng cách gắn vào các phan tử nhỏ hoặc bằng quá trình phosphoryl hóa, kiểu hoạt hóa này không thuận nghịch.
Protein kết hợp với DNA theo một vài cách khác nhau
Rất nhiều các protein có liên kết với DNA. Những protein này có liên quan đến quá trình tái bản DNA, trong quá trình biểu hiện gen và sự điều khiển quá trình đó, trong việc bảo vệ và sửa chữa DNA, và nhiều các quá trình khác. Sự hiểu biết về các thuộc tính của protein liên kết với DNA là cơ sở quan trọng trong công nghệ sinh học, lĩnh vực mà chúng được sử dụng để điều khiển sự biểu hiện gene tái tổ hợp. Protein liên kết với DNA cũng có vai trò rất lớn trong nghiên cứu y học phân tử, đặc biệt là trong nghiên cứu ung thư và lão hóa. Mặc dù 1 số lượng rất lớn protein liên kết với DNA, nhưng chỉ có một vài cách phổ biến để những protein này tương tác với DNA.
Mặc dù có 1 vài protein liên kết với DNA theo cách không đặc hiệu, nhưng đa số nhận biết và bám vào các trình tự đặc hiệu trên DNA. Hầu như tất cả protein liên kết với DNA bám vào các rãnh lớn của DNA sợi kép, cho phép chúng nhận biết và tiếp xúc với các bazơ. Khi 1 số vị trí được nhận biết bởi một protein bám DNA nhất định được so sánh với nhau, chúng được nhận thấy có rất nhiều trình tự tương đồng, mặc dù hiếm khi giống nhau hoàn toàn. Rất nhiều các protein liên kết DNA, gồm cả protein điều hòa và enzyme cắt hoặc biến đổi DNA, nhận biết các trình tự lặp đảo dài khoảng 4 đến 8 cặp bazơ (bp) trên phân tử DNA. Trong trường hợp này, protein chứa các tiểu phần đơn thường liên kết với phần lặp đảo có tổng chiều dài 4-8 bp. Các protein chứa các tiểu đơn vị cặp đôi thường bám vào các trình tự lặp đảo dài 5 hoặc 6 bp cách nhau khoảng một
trình tự gồm nửa tá cặp bazơ không thực sự quan trọng (hình 7.44). Những đoạn lặp đảo ngắn như vậy sẽ không tạo được cấu trúc kẹp tóc hay cấu trúc cuống và vòng (thòng lọng.)
Một số lượng lớn các yếu tố phiên mã khác nhau và các protein điều hòa khác liên kết với DNA bằng các vùng liên kết với lượng tương đối nhỏ các vùng DNA kết hợp với protein. Các dạng đã được biết đến nhiều nhất gồm helix-turn-helix (HTH), helix-loop- helix (HLH), leucine zipper (khóa kéo leucine) và zinc finger (ngón tay kẽm).
Cả helix-turn-helix và cấu trúc tương tự nhưng phân biệt là helix-loop-helix đều có cấu tạo bởi 2 đoạn xoắn alpha helix nối với nhau bởi một đoạn vòng quay (loop) (hình