Các phương pháp tiến hành nghiên cứu

2.2.2.1. Khuếch đại đoạn gen biến nạp LBT bằng kỹ thuật PCR ● Tách chiết DNA khuôn mẫu từ chủng ETEC

- Lấy dịch khuẩn đó nuụi qua đêm cho vào ống falcol 5ml, ly tâm 3000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.

- Thêm 200μl dung dịch Sol I (resuspension solusion), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II (lysis buffer), đảo nhẹ.

- Thêm 350μl dung dịch Sol III (neutralization), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút. - Ly tâm 14000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.

- Cho 500àl preperation solution vào cột miniprep colunm - Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, thu kết tủa.

- Cho phần dịch nổi trên vào cột miniprep vừa ly tâm - Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, thu kết tủa

- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500μl-700àl optinal Wash Solution, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút.

- Làm khô DNA bằng máy , sau đó thêm 100μl nước khử ion,

để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid có thể được bảo quản ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

● Thực hiện phản ứng PCR:

- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn , tớnh và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn được giống nhau và đạt khoảng 200ng/ml

- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy. Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng

Dung dịch đệm (10X) dNTPs

Primer BamHI- F Primer XhoI- R

Taq DNA polymerase

DNA plasmid được tách từ vi khuẩn Nước khử ion vô trùng

Chu trình nhiệt 950 C : 5 phút 940C : 30 giây 640C : 30 giây 30 chu kỳ 720C : 1 phút 720C : 3 phút

● Chạy điện di và tinh sạch đoạn gen LTB

- Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% trong 30 phút ở hiệu điện thế 100V, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommide. Chụp ảnh để ghi lại kết quả điện di bằng hệ thống máy Genedoc, BioRad.

- Tinh sách sản phẩm PCR bằng kít tinh sạch DNA cảu (QIAGEN)

2.2.2.2. Nuôi cấy và tinh sạch Plasmid pGEX

- Chủng E. Coli HD5α có chứa plasmid pGEX được nuôi cấy qua đêm trên môi trường canh thang LB có chứa 100àg ampicillin/lit

- Lấy 1 huyền dịch khuẩn đó nuụi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.

- Thêm 100μl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 200μl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/ thể tích: w/v)), đảo nhẹ.

- Thêm 150μl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.

- Bổ sung dung dịch chloroform : isoamyl (24:1) theo tỷ lệ 1:1.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1.5ml mới.

- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.

- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500μl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút. - Làm khô DNA bằng máy , sau đó thêm 50μl nước khử ion,để ở nhiệt

độ phòng cho tan hoàn toàn.

- Kiểm tra độ tinh sạch Plasmid bằng cách điện trên thach điện - Bảo quản ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2.3. Biến nạp đoạn gen ELTB vào vector pGEX

Đoạn gen ELTB mã hóa tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiờt của ETEC sẽ được biến nạp vào vector biểu hiện pGEX. ELTB protein sẽ được tổng hợp trong tế bào E. Coli BL21 dưới sự điều khiển của Tac promoter (hình 2.2).

EltB

ACCBamHI XhoIGCC

2.2.2.3.1. Cắt đoạn gen EltB và plasmid pGEX bằng các enzyme giới hạn

Đoạn gen eltB và plasmid pGEX sau khi được tinh sạch sẽ được cắt bằng Enzyme giới hạn XhoI và BamH1 theo tỷ lệ

Thành phần Thể tích (àl) BamH1 1 Xho1 1 Buffer 1 DNA 2 H20 5 Tổng số 10 Ủ ở 370C trong 5 giờ

Điện di kiểm tra sản phẩm cắt

Tinh sạch sản phẩm cắt: sử dụng kít tinh sạch của QIAGEN

2.2.2.3.2. Nối đoạn gen ELTB vào vector pGEX

Sau khi cắt bằng Enzyme giới hạn đoạn gen EltB sẽ được nối vào vector pGEX bằng ligation kit (promega) theo qui trình sau

Thành phần Thể tớch(àl) Ligate bufer 10X 2 EltB DNA 5 pGEX plasmid 2 Ligate 1 H20 10 Tổng số 20

Ủ ở nhiệt độ 160C trong 16-18 giờ

Biến nạp sản phẩm ligate vao tế bào biến nạp E. Coli DH5α theo các bước như sau:

Trộn hỗn hợp ligate với 100àl tế bào biến nạp E. Coli DH5α, ử trong đá mạt 30 phút

Cho hỗn hợp trở lại đá mạt trong 2 phút Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng 2 phút

Nhỏ vào hỗn hơp 1ml môi trường canh thang SOC, ủ 30 phút ở 370C Ly tâm 2500v/5 phút ở 40C

Lấy 100àl cặn lỏng lờn môi trường thạch LB có chứa 100àl/l ampicillin ủ ở 370C qua đêm.

Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR

2.2.2.3.3. Kiểm tra đoạn gen biến nạp + Kỹ thuật PCR colonies

Nguyên lý:

Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu DNA được thay thế bằng DNA plasmid được giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94o C đến 95o C, màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu, hoặc mồi vector.

Tiến hành:

Hòa tan tế bào vi khuẩn trong nước khử ion. Sau đó sử dụng hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR.

+ Kỹ thuật cắt Enzyme giới hạn:

Những plasmid tái tổ hợp đã được kiểm tra bằng phản ứng PCR cho kết quả dương tính tiếp tục được kiểm tra bằng enzym giới hạn. Các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp này được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, có bổ sung Ampicilin. Sau đó, DNA của những plasmid tái tổ hợp được tách chiết theo quy trình và được xử lý với các enzym giới hạn.

Thành phần phản ứng cắt plasmid mang đoạn EltB với enzym BamHI và XhoI như sau:

Nước cất 2× 5,0

Đệm Buffer 10× 1,0

Enzym BamHI 1,0

Enzym XhoI 1,0

DNA plasmid -EltB 2,0

Tổng 10,0

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 5 giờ, sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

+ Giải trình tự gen:

- Cách pha hỗn hợp phản ứng cho bigdye -PCR: Thành phần phản ứng 1 mẫu (àl) Sản phẩm PCR tinh sạch 1.5àl Mồi 2.0 àl Bigdye 2.5X 3.0 àl Buffer 5X 4.0 àl Nước siêu sạch 9.5 àl Tổng số: 20 àl

- Chương trình nhiệt cho bygdye-PCR

1 960C : 1 phút 960C : 30giây

2 500C : 30 giây 30 chu kỳ 600C : 4 phút

3 Giữ ở 40C

- Đọc trình tự gen bằng máy đọc trình tự ABI (Applied Biosystem) - So sánh các đoạn gen và được so sánh với các trình tự chuẩn của ngân hàng gen

2.2.2.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB

- Tinh sạch plasmid pGEX-EltB

Chủng vi khuẩn E. Coli DH5α có chứa Plasmid pGEX-EltB được nuôi cấy qua đêm trong môi trường canh thang LB có chứa 100àg ampicillin sau đó được ly tâm lấy căn tế bào và tách chiết plasmid (như ở bước 2.2.2.2)

- Biến nạp plasmid pGEX-ELTB vào tế bào biểu hiện protein E.coli BL21

Lấy 1àl plasmid pGEX-ELTB cho vào 100àl tế bào biến nạp E. Coli BL21

Ủ trong hỗn hợp trong đá 30 phút

Cho hỗn hợp vào trong máy ủ nhiệt ở 420C Để trở lại trong đá 1 phút

Cho ra nhiệt độ phòng 1 phút

Nhò vào hỗn hơp 1ml môi trường canh thang SOC, ủ 30 phút ở 370C Ly tâm 2500v/5 phút ở 40C

Lấy 100àl cặn lỏng lờn môi trường thạch LB có chứa 100àl/l ampicillin ủ ở 370C qua đêm.

Kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR

- Biểu hiện protein tái tổ hợp ELTB

Nuôi cấy chủng vi khuẩn E. Coli BL21-pGEX-ELTB trong 50ml môi trường canh thang LB-ampicillin ở 370C trong 5-6 giờ (nồng độ OD = 0,5-0,7)

Nhỏ hoạt chất kích thích sinh protein ITPG (nồng độ cuối cùng trong huyền dịch đạt 1 mM/l) ủ 370C trong 5-6 giờ

Hòa cặn tế bào vi khuẫn vào trong 3ml dung dịch PBS 1x

Nhỏ 80àl dung dịch Lysozyme nồng độ 10mg/ml, ủ ở 220C trong 10 phút Nhỏ 30àl dung dich triton X-100

Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm máy Braun sonicator Ly tâm 10.000 vòng/ 15 phút thu dịch nổi

Trộn dịch với 2ml glutathion-sepharose gel

Ủ hỗn hợp ở 40Ctrong 18 giờ sau đó chuyển hỗn hợp sang cột tinh sạch protein

Rửa cột bằng 20ml PBS có chứa 0,1% Triton X-100

Thu hoạch 1ml trong một lần sau đó phân tích protein tái tố hợp ELBT bằng điện di trên gel SDS-polyacrylamide 12% và nhuộm gel bằng Coomasie Blue R250.

2.2.2.5 Kiểm tra protein EltB bằng Western blot

Western blot là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

electrophoresis)Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:

- Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE.- Các

protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel.- Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-khỏng thể đối với protein quan tâm.- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợ

trí như đã phân tách trên gel.

- Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody). Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.

- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào protein.

- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein- khỏng thể sơ cấp-khỏng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm.- Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.

- Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.

2.2.2.6. Gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đa dũng khỏng EltB

Đối tượng nghiên cứu Protein:

- Protein tái tổ hợp E LtB được sản xuất trong nghiên cứu - Protein tái tổ hợp ELtB chuẩn (SIGMA) để làm chứng dương

Động vật gây miễn dịch: Thỏ

- Tổng số 8 con thỏ được chia làm hai nhóm

- Tiêu chuẩn chọn thỏ: Thỏ cỏi cỏi tơ, chưa đẻ (thỏ non), trọng lượng: 1,5-1,8kg/con

+ Nhóm 1(6 con): Gây miễn dịch Protein tái tổ hợp LtB được sản xuất trong nghiên cứu để tạo kháng thể đa dũng khỏng LT

+ Nhóm 2(2 con): Sử dụng làm nhóm chứng chỉ tiêm nước muối sinh lý Địa điểm gây miễn dịch: Phũng nuôi động vật, Bộ môn dược Lý - Trường đại học Y Hà Nội

Thời gian gây miễn dịch: 6 tháng

Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu động vật thực nghiệm

Phương pháp tiến hành

Chuẩn bị huyền dịch kháng nguyên

Qui trình gây miễn dịch: chia làm 3 đợt mỗi đợt cách nhau 2 tuần: +Nhóm 1: Gây miễn dịch tạo kháng thể đa dũng khỏng LT

- Đợt 1 (Ngày thứ nhất): Tiêm bắp 0,3ml (50àg LtB) + 0,3ml complet

ajuvant

- Đợt 2 (ngày thứ 14): Tiêm bắp 0,3ml (50àg LtB) + 0,3ml incomplet

ajuvant

- Đợt 3 (Ngày thứ 28): Tiêm bắp0,3ml (50àg LtB) + 0,3ml incomplet

ajuvant

+ Nhóm 2: Nhóm chứng (tiêm nước muối sinh lý)

- Đợt 1 (Ngày thứ nhất): Tiêm bắp 0,6ml NaCL 0,85% - Đợt 2 (ngày thứ 14): Tiêm bắp 0,6ml NaCL 0,85% - Đợt 3 (Ngày thứ 28): Tiêm bắp 0,6ml NaCL 0,85%

Theo dõi sự phát triển của thỏ

Kiểm tra hiệu giá kháng thể gây miễn dịch + Thu thập các mẫu huyết thanh:

- Các mẫu huyết thanh thỏ được thu thập vào các ngày 0, 13, 27 và 41 của các đợt gây miễn dịch.

Kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng kỹ thuật ELISA.

o Phiến ELISA đáy bằng được gắn kháng nguyên LTB nồng độ 0,5àg/giếng trong dung dich PBS 1X, pH7,2 ử qua đem ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

o Rửa 3 lần X3 phút bằng dung dịch PBS 1X (0,05% tween)

o Phủ bản bằng dung dung dịch BSA 2% trong PBS 1X trong 2 giờ ở 370C

o Rửa 3 lần X3 phút bằng dung dịch PBS 1X (0,05% tween)

o Pha loãng huyết thanh thỏ vào các giếng bắt đầu từ nồng độ pha loãng 1/40; 1/80; 1/160; 1/320…..trong dung dịch PBS có 1% BSA. Ủ ở 370C trong 1 giờ

o Rửa 3 lần X3 phút bằng dung dịch PBS 1X (0,05% tween)

o Nhỏ kháng thể kháng IgG thỏ gắn Enzyme (conjugate). Ủ ở 370C trong 1 giờ

o Rửa 3 lần X3 phút bằng dung dịch PBS 1X (0,05% tween)

o Cho chất phát triển màu (Subtrate) 10-15 phút

o Dừng phản ứng bằng Dung dịch H2SO4 2M: 50àl/giếng

o Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm

o Tính hiệu giá đáp ứng kháng thể của thỏ băng phầm mềm EXEL

Thu hoạch kháng thể

Tuần thứ 6 (ngày thứ 42) kể từ đợt miễn dịch đầu tiên thỏ được lấy máu và thu hoạch kháng huyết thanh theo qui trình dưới đây:

+ Hai ngày trước khi lấy máu thỏ chỉ được uống nước (không ăn) nhằm hạn chế thành phần prụtein khỏc của huyết thanh, lipit…

+ Lấy máu động mạch cổ bằng dụng cụ lấy máu vô trùng váo cỏc ống Falcon 50 ml

+ Để tủ lạnh ở 40C trong vòng 3 giờ

+ Ly tâm máu 2500 vũng/ phỳt X 5 phút. Sau đó chắt huyết thanh + Huyết thanh được ly tâm tiếp 10.000 vũng/ phỳt X 20 phút để loại bỏ cặn + Bất hoạt bổ thể ở nhiệt độ 560C trong vòng 1 giờ

+ Cho thêm NaN3 vào huyết thanh đạt nồng độ là 0,001% + Đóng ống 1ml giữ ở nhiệt độ -200C

Tinh sạch kháng thể đa dòng

- Tinh sạch kháng thể : Kháng thể đa dòng sẽ được tinh sạch bằng kít tinh sạch kháng thể Protein G (SIGMA)

- Đo nồng độ kháng thể sau khi tinh sạch: Đo nồng độ kháng thể sau khi tinh sạch kít đo nồng độ protein (promega)

CHƯƠNG 3

DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thiết kế và biểu hiện thành công protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên quy mô phòng thí nghiệm

2. Sản xuất kháng thể kháng protein tái tổ hơp EltB trên quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 4

DỰ KIẾN BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN

DỰ TRÙ KINH PHÍ

Kinh phí trích từ đề tài. “Nghiên cứu quy trình sản xuất bộ sinh phẩm

immunoblotting chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của E.coli sinh độc tố ở trên một số nhóm thực phẩm” Đề tài được tài trợ kinh phí từ ngân sách

KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH VÀ NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI