CTX-M-3 CTX-M-9 SHV TEM CTX-M-3+ CTX-M-9
3.3.2. Xác định tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng
sinh nhóm Quinolon (qnr) nằm trên plasmid
Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), với các cặp mồi đã thiết kế nhằm mục đích xác định các gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon nằm trên
plasmid: qnrA, qnrB, qnrS. Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu trên 107 chủng
K.pneumoniae. Kết quả thu được có 41/107 chủng có mang gen mã hóa sự kháng
kháng sinh nhóm Quinolon trên plasmid, chiếm tỷ lệ 38,3%.
Hình 3.3. Kết quả PCR xác định sự có mặt của gen
kháng qnr nằm trên plasmid
M: Mẫu chuẩn (ADN 100bp)
1-3: Chứng dương qnrA; qnr B; qnr S
4,5,7,10,11,14,15: Chủng PCR (-): 3487d, 3611d, 3995d, 4619d, 4845d, 1231d,
1260d
6,8,912,13,16: Chủng PCR (+) : 3700d, 4336d, 4580d, , 4884d, 565d, 1307d. Bảng 3.28. Phân bố các chủng mang gen kháng quinolon nằm trên plasmide
(n=41)
Gen mã hóa Số lượng (n) Tỉ lệ (%) p
qnrA 1 2,4
P< 0,05
qnrB 7 17
qnrS 33 80,6
Kết quả cho thấy tỷ lệ chủng mang gen kháng Quinolon nằm trên plasmid trong nghiên cứu này khá cao. Tất cả 107 chủng đưa vào nghiên cứu về gen mã hóa sự kháng kháng sinh đều đã có chứa các gen mã hóa sự kháng C3G như kết quả phần trên, nhưng kết quả này cho thấy đồng thời có 38,3% số chủng mang gen mã
hóa kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr); Trong đó chủ yếu là qnrS (80,6 %),
qnrB (17 %) và gen qnrA chiếm tỉ lệ rất nhỏ (2,4 %).
Phân bố chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự
kháng nhóm Quinolon trên plasmid
2.4
17
80.6
qnrA qnrB qnrS
Biểu đồ 3.17. Phân bố các chủng mang gen kháng quinolon
3.3.3. Tỷ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr
Tổng hợp hai phần nghiên cứu trên, chúng tôi thấy, có một tỷ lệ khá cao chủng mang đồng thời nhiều gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm C3G và nhóm Quinolon nằm trên plasmid:
Bảng 3.29. Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr
Các gen mã hóa Số lượng
(n = 107) Tỉ lệ % p
qnr+CTX-M+SHV+TEM 24 22,4
p< 0,05
CTX-M+SHV+TEM 91 85
CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM 9 8,4
Kết quả trên cho thấy: tỷ lệ các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng C3G là rất cao 85%, chủng đồng thời mang gen CTX-M-3 và CTX-M-9 là 10,3%, chủng mang tất cả các gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G là 8,4%. Trong số các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G
có 22,4% chủng mang cả gen mã hóa sự kháng sinh nhóm Quinolon(qnr).
Tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang
nhiều gen mã hóa kháng C3G và quinolon 22.4 85 10.3 8.4 qnr+CTX-M+SHV+TEM CTX-M+SHV+TEM CTX-M-3+ CTX-M-9 CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM
Biểu đồ 3.18. Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr
3.3.4. Khẳng định các gen mã hóa kháng kháng sinh đã được phát hiện nằm trên plasmid bằng kỹ thuật Southern Blot.
Với điều kiện cho phép về kinh phí, bằng kỹ thuật Southern Blot, với enzym giới hạn S1, để cắt đặc hiệu trên ADN plasmid, chúng tôi đã tiến hành xác định các gen mã hóa được phát hiện nằm trên plasmid của 46 chủng.
a) b)
Hình 3.4.a và 3.4.b
3.4.a - Sản phẩm PCR đã được enzym giới hạn S1 phát hiện bằng điện di xung trường
M: Mẫu chuẩn ADN
1 – 19: 3487d, 3611d, 5233d, 3870d, 4690d, 5319d, 3431d, 5022d, 6035d, 861d, 1133d, 1307d, 1707d, 1713d, 2166d, 2371d, 2376d, 2523d, 276d.
3.4.b - Kết quả của kỹ thuật Southern Blot: làm xuất hiện các mảnh cắt của ADN plasmid .
7- 19: 3431d, 5022d, 6035d, 861d, 1133d, 1307d, 1707d, 1713d, 2166d, 2371d, 2376d, 2523d, 276d được phát hiện bằng kỹ thuật Southern Blot
Hình ảnh các băng hiện rõ trên ảnh 17a và 17b, cho biết các ADN của đoạn gen khuếch đại bằng kỹ thuật PCR đã được cắt bởi các enzym đặc hiệu cho ADN plasmid là S1, xác định chắc chắn các gen này nằm trên plasmid.
Chương 4 BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm phân bố các chủng vi khuẩn gây bệnh trong nhiễm khuẩn hô hấp ở bệnh nhi 0 đến 6 tuổi và một số yếu tố liên quan
Phương pháp thu thập mẫu trong đề tài này là thu thập mẫu thuận tiện, chính vì vậy mà nó mang những ưu điểm và những hạn chế nhất định:
- Ưu điểm: Mẫu được chỉ định làm theo thường quy nên quy trình lấy mẫu, vận chuyển, bàn giao mẫu cho phòng xét nghiệm và thực hiện xét nghiệm được làm theo hướng dẫn thường quy của bệnh viện tiết kiệm nhiều công sức cũng như thời gian và kinh phí cho nghiên cứu. Thời gian thu thập mẫu kéo dài cho tới khi đủ cỡ mẫu nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu trong một năm thì đủ số lượng mẫu dự kiến và thời gian cho phân tích một số yếu tố liên quan.
- Hạn chế: Thu thập mẫu thuận tiện theo thường quy do rất nhiều người thực hiện kỹ thuật, kỹ năng và độ thành thạo rất khác nhau sẽ không kiểm soát được kỹ thuật thu thập mẫu và thời gian vận chuyển mẫu có đảm bảo hay không, điều đó có ảnh hưởng tới tỷ lệ phân lập tác nhân gây bệnh và kết quả của nghiên cứu về mặt tác nhân. Đây cũng chính là lý do mà nghiên cứu của chúng tôi chỉ phân lập được 1.181 mẫu dương tính với vi khuẩn trong số 3.567 mẫu.
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập tác nhân trong đề tài là phương pháp cấy đếm. Đây là phương pháp tối ưu cho chẩn đoán các căn nguyên gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính. Sở dĩ như vậy là vì đường hô hấp mở thông với bên ngoài nên đường hô hấp sẽ có rất nhiều các tác nhân gây bệnh bình thường là sống cộng sinh, khi có điều kiện thuận lợi trở thành tác nhân gây bệnh thể hiện bằng số lượng có mặt của tác nhân trong đường hô hấp.
Kỹ thuật định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ được thực hiện ở phòng xét nghiệm hiện đại của Bệnh viện Nhi trung ương và kỹ thuật xác định ESBL, kỹ thuật xác định gen kháng kháng sinh tại Phòng nghiên cứu kháng thuốc của Khoa vi sinh tại Bệnh viện Several – Hàn quốc theo tiêu chuẩn của Viện tiêu chuẩn xét nghiệm lâm sàng quốc tế (CLSI) nên kết quả đảm bảo độ tin cậy cao [85].
Kỹ thuật xác định gene kháng kháng sinh của vi khuẩn được thực hiện tại phòng xét nghiệm nghiên cứu kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn tại Bệnh viện Sevral thuộc đại học tổng hợp Yonsei Hàn Quốc - là một trong những bệnh viện danh tiếng.
Sự phân bố căn nguyên nhiễm khuẩn đường hô hấp ở bệnh viện có những đặc điểm khác với nhiễm khuẩn đường hô hấp ở cộng đồng, đặc biệt ở các khoa hồi sức cấp cứu, ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, đồng thời có sự khác nhau giữa nhóm bệnh nhân vào viện ở nhóm NKHHCT với nhóm bệnh nhân ở nhóm NKHHCT kết hợp.
4.1.1. Sự phân bố mẫu bệnh phẩm nhiễm khuẩn hô hấp theo nhóm bệnh và theo khoa lâm sàng.
Từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010, có tổng số 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp được nuôi cấy xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ở các khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp đã được đưa vào nghiên cứu. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này được thu thập từ bệnh nhi dưới 6 tuổi có 1.181 mẫu bệnh phẩm phân lập được vi khuẩn trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp, cho thấy tỷ lệ nuôi cấy dương tính với các vi khuẩn gây bệnh là 33,1%, trong đó có 87 mẫu có hai loài chiếm 7,4%.
Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này thuộc hai nhóm bệnh nhân:
- Nhóm vào viện điều trị với chẩn đoán ban đầu là nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính - gọi là nhóm NKHHCT (gồm những bệnh nhân vào với chẩn đoán NKHHCT ở các khoa Hồi sức cấp cứu, Sơ sinh và khoa Hô hấp) có 1.909 mẫu bệnh phẩm.
- Nhóm vào viện điều trị với chẩn đoán ban đầu không phải là nhiễm khuẩn đường hô hấp, mà NKHHCT là bệnh đi kèm hoặc xuất hiện sau thời gian nằm điều trị - gọi là NKHHCT kết hợp (gồm những bệnh nhân vào điều trị ở các khoa Hồi sức cấp cứu, Sơ sinh và Hồi sức ngoại) có 1.658 mẫu bệnh phẩm.
Tỷ lệ dương tính ở bảng 3.2 cho thấy, tỷ lệ nuôi cấy dương tính chung là 37,4% ở nhóm bệnh NKHHCT và 28,1% ở nhóm bệnh NKHHCT kết hợp. Cao nhất ở khoa sơ sinh (nhóm NKHHCT là 48,8% và nhóm NKHHCT kết hợp là 54,7%) ,
sau đó là khoa hô hấp (37,5%) và thấp nhất là khoa HSCC (21,1% và 22,2%). Như vậy, ta thấy tỷ lệ dương tính chung ở nhóm nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính cao hơn nhóm NKHHCT kết hợp và tỷ lệ cao nhất là khoa sơ sinh. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Kết quả của chúng tôi tương tự như nghiên cứu khác về tỷ lệ cao các nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính thường gặp ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ [4].
Ở biểu đồ 3.3 tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài vi khuẩn/1 bệnh phẩm ở nhóm NKHHCT là 7% và ở nhóm NKHHCT kết hợp là 7,9%. Không có sự khác biệt về tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài/ 1 bệnh phẩm thu được ở bệnh nhân NKHHCT và NKHHCT kết hợp với p>0,05.
Juhi Taneja và cộng sự nghiên cứu tại Ấn Độ trên trẻ ở độ tuổi trung bình dưới 6 tuổi có viêm cấp đường hô hấp dưới với tỷ lệ dương tính là 58,6%, trong đó 8,6% phân lập có 2 loài [66]; Nghiên cứu của các tác giả Brazil về tỷ lệ và các yếu tố phơi nhiễm viêm đường hô hấp dưới ở trẻ dưới 5 tuổi cho thấy tỷ lệ trẻ nhiễm khuẩn hô hấp dưới ở các bệnh nhi là 23,9% [104]. Filiz Günseren và cộng sự cho biết tỷ lệ này ở Thổ Nhĩ Kỳ là 38,8% [51]; Nghiên cứu của các tác giả Trung quốc về tỷ lệ viêm đường hô hấp dưới - 29,7%; Hàn Quốc tỷ lệ viêm đường hô hấp - 25,3%. Như vậy, tỷ lệ nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ở trẻ em dao động khá nhiều; trong đó nghiên cứu của các tác giả Ấn độ và Thổ Nhĩ Kỳ cao hơn của chúng tôi còn nghiên cứu của chúng tôi cao hơn của Brazil.
Từ tháng 2/2002 - 6/2003 Ngô Thị Thi và cộng sự đã nghiên cứu căn nguyên nhiễm khuẩn từ dịch hút phế quản trẻ em ở bệnh viện Nhi Trung ương cho thấy tỷ lệ dương tính là 69,6% [11]; Nguyễn Văn Bàng - Bệnh viện Bạch Mai nghiên cứu trên bệnh nhi 2 tháng đến 5 tuổi viêm phổi điều trị ở khoa Nhi (2009) với tỷ lệ 31,5% [20]; Cao Minh Nga - Bệnh viện Thống Nhất năm 2006 (25,7%) [5]. Nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2009-2010 chỉ còn 33,1%, giảm hơn một nửa so với nghiên cứu của Ngô Thị Thi; Như vậy cho thấy sự khác biệt này có thể là do thực hiện vô trùng trong chăm sóc tại các khoa đặc biệt là các khoa hồi sức đã được cải thiện đáng kể trong nhiều
năm qua. Bên cạnh đó tỉ lệ phân lập được 2 loài vi khuẩn trên 1 bệnh phẩm của Ngô Thị Thi là (1,4), của chúng tôi cao hơn (7,4). Nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ tương đương Nguyễn Văn Bàng trong cùng thời điểm, cao hơn nghiên cứu của Cao Minh Nga.
4.1.2. Sự phân bố của các tác nhân vi khuẩn phân lập được
Qua bảng 3.3 ta thấy đứng đầu là Klebsiella pneumoniae (22,61%) sau đó là
Acinetobacter spp. (19,9%), P. aeruginosa (18,37%). Các căn nguyên thường gặp ở
cộng đồng không cao S. pneumoniae (5,08%), H. influenzae(5,33%).
Qua bảng 3.4 ta thấy, tỷ lệ phân lập được Klebsiella pneumoniae là cao nhất (24,1%) ở nhóm bệnh NKHHCT và Acinetobacter spp. (29,8%) ở nhóm bệnh NKHHCT kết hợp, sau đó là P. aeruginosa (17,4%) ở nhóm bệnh NKHHCT và
Klebsiella pneumonia (20,3%) ở nhóm bệnh NKHHCT kết hợp. Các cầu trùng gram
dương có tỷ lệ từ 5,0% đến 7,8%. Có sự khác biệt của các vi khuẩn phân lập được ở
nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp như Acinetobacter spp. (13,4 và 29,8%); H.
influenzae (7,4 và 2,1%); S. pneumoniae (6,7% và 2,6%). Sự khác biệt này có ý
nghĩa thống kê với p<0,02, phù hợp với thống kê về tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp ở cộng đồng và ở bệnh viện (NKHHCT có bao gồm các bệnh nhân
nhiễm khuẩn từ cộng đồng). Klebsiella pneumonia và các vi khuẩn gram âm khác
vẫn là vi khuẩn đứng hàng đầu ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp có thể vì bệnh nhân là trẻ nhỏ và đã được điều trị ở các tuyến dưới [40].
Tác giả Taneja và cộng sự - Ấn Độ nghiên cứu viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi
có tỷ lệ K. pneumoniae 32,2%, S. pneumoniae 10%, E. coli 10%, P. aeruginosa 5,7%, S. aureus 2,8% và H.influenzae 1,4% [103]. Nghiên cứu của tác giả F.
Günseren và cộng sự - Thổ Nhĩ Kỳ nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn gram âm ở khoa Hồi sức cấp cứu của 9 bệnh viện ở Thổ Nhĩ Kỳ cho thấy căn nguyên hàng đầu
thường gặp là các loài gram âm 26,8%. Đứng đầu là P. aeruginosa 22,1%, loài
Klebsiella spp trong đó K. peumoniae chiếm 66%; E.coli, Acinetobacter spp và Enterobacter spp 26,2% [51].
Tác giả Ngô Thị Thi và cộng sự ở Bệnh viện Nhi Trung ương nghiên cứu thấy các tác nhân vi khuẩn phân lập được từ dịch hút phế quản phân bố chủ yếu là
các trực khuẩn gram âm: Klebsiella spp: 42,12%; P.aeruginosa: 26,92% E.coli: 14,56%, Acinetobacter: 1,28%, các trực khuẩn gram âm khác: 6,5%; Nhóm cầu khuẩn gr (+): S. viridans : 4,94%, S. aureus: 2,29% , S. pneumoniae: 0,36%; Nhóm cầu khuẩn gr (-): N. meningitidis: 0,09%, M. catarrhalis: 0,36%. Qua đó, nghiên
cứu của chúng tôi, của tác giả Ngô Thị Thi và các tác giả Ấn Độ đều cho thấy căn
nguyên hàng đầu là Klebsiella spp và P. aeruginosa. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sau K. pneumoniae, Acinetobacter chiếm tỷ lệ đáng quan tâm tới 19,9% cao hơn rất nhiều nghiên cứu của các tác giả khác; tỷ lệ Klebsiella spp. trong nghiên cứu của
Ngô Thị Thi và cộng sự thấp hơn của chúng tôi rất nhiều.
Tỷ lệ phân bố các vi khuẩn phân lập được trong các nghiên cứu đều thấy nổi trội chiếm ưu thế là các trực khuẩn Gram âm.
Qua biểu đồ 3.4 cho thấy chủ yếu các căn nguyên vi khuẩn phân lập được chung cho cả hai nhóm là trực khuẩn gram âm chiếm 80,8%, cầu khuẩn gram dương chỉ có 18%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p< 0,5. Kết quả nghiên cứu với tỷ lệ trực khuẩn gram âm chiếm đa số là dấu hiệu cảnh báo về khả năng kháng thuốc, đặc biệt là kháng thuốc lan truyền plasmid là rất lớn. Nguy cơ thất bại điều trị trong nhóm này là rất cao [25].
Tại biểu đồ 3.5, ta thấy trực khuẩn gram âm chiếm đa số ở cả 2 nhóm (77,5- 84,9%), trong đó nhóm NKHHCT kết hợp cao hơn nhóm NKHHCT. Tỷ lệ cầu trùng ở nhóm NKHHCT cao hơn nhóm NKHHCT kết hợp. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p<0,01. Qua các biểu đồ, một lần nữa cho thấy tỷ lệ phân bố các vi khuẩn phân lập được trong các nghiên cứu đều nổi trội chiếm ưu thế là các trực khuẩn Gram âm. Ở đây ta cũng thấy tỷ lệ cầu trùng ở nhóm NKHHCT (bao gồm cả những bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hấp ở cộng đồng) cao hơn nhóm NKHHCT kết hợp. Điều đó cho thấy sự phù hợp về cơ cấu căn nguyên mà các nghiên cứu đã thống kê.
4.1.3. Tỷ lệ phân bố các chủng K. pnemoniae phân lập được
Klebsiella spp. là vi khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều bởi khả năng đa
kháng kháng sinh, lan truyền thành dịch đa kháng và siêu kháng kháng sinh. Điều trị
nhiễm khuẩn Klebsiella spp. khó khăn và là nguyên nhân tử vong của nhiều ca bệnh [1],
[19], [39], [66].
Các nghiên cứu trên cho thấy tỷ lệ phân lập Klebsiella spp. ở bệnh viện là
khác nhau tùy từng quốc gia thay đổi từ 10,2% - 32,2%. Phần lớn gặp ở trẻ sơ sinh non yếu và trẻ nhỏ. Chúng là chủng vi khuẩn quan trọng có khả năng kháng lại nhiều kháng sinh và gây bùng phát dịch trong bệnh viện [49], [66], [110].
Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được ở các khoa và theo tuổi được
trình bày trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ các bệnh nhi nhiễm khuẩn