2.3.1. Trang thiết bị
*Thiết bị để nghiên cứu về thực vật:
- Máy ảnh, thiết bị phân tách ADN điện di bằng bản gel agarose, thiết bị giải trình tự gen tự động Nextseq 500.
* Thiết bị nghiên cứu thành phần hoá học và xác định cấu trúc các chất:
- Máy quang phổ UV-Vis Cary 60 tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN.
- Bản mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck, Germany) được hoạt hoá ở 1100C trong 1giờ.
31
- Thiết bị siêu âm Utrasonic cleaner- MRC tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. - Máy đo pH AL 20 pH- Aqualitic tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN.
- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN.
- Máy đo điểm chảy Kofler micro-hotstage tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN.
- Máy đo phổ ICP-MS, Perkin Elmer, tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. - Phổ hồng ngoại được đo dưới dạng viên nén KBr trên máy Impact 410 Nicolet tại Viện Hoá học, VHLKHCNVN.
- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI- MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap tại Viện Hoá học, VHLKHCNVN.
- Phổ cộng hưởng từ (1D và 2D-NMR) được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT- NMR tại Viện Hoá học, VHLKHCNVN.
*Thiết bị thử tác dụng sinh học, thực hiện tại Viện Dược liệu và Trường ĐH Y Hà Nội:
- Máy đo phản ứng đau tail-flick (series 16881), sản xuất bởi Ugo – Basile, Italy - Máy đo quang UV-Vis mini 1240 Shimadzu, Nhật Bản.
- Máy nghiền đồng thể hãng IKA, Malaysia. - Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout
- Máy xét nghiệm huyết học tự động ABC (Animal Blood Counter). - Máy xét nghiệm hóa sinh máu Screen master
- Máy Hot plate model – DS37, hãng Ugo-Basile.
2.3.2. Hóa chất
- Thuốc đối chiếu: Silymarin (biệt dược Safegan® 70)
- Thuốc đối chiếu: Aspirin (Aspégic) gói bột 100mg của hãng Sanofi aventis, Pháp - Chất chuẩn: Codein phosphat (99.2 %), aconitin (99.0 %), D-glucose (98.6 %), quercetin (99.0 %) của hãng Fermentas (Đức), Sigma Aldrich (Mỹ).
- Nhũ dịch OA (Ovalbumin + Al(OH)3): dùng làm kháng nguyên gây mẫn cảm cho chuột.
- Hồng cầu cừu: máu tĩnh mạch cừu được lấy trong điều kiện vô trùng, bảo quản trong dung dịch alsever (glucose 24.6 g, natricitrat 9.6 g, natriclorid 5.05 g, nước cất vừa đủ
32
1200 ml, pH 6.1), ở nhiệt độ 4 0C, sử dụng trong thời hạn 2 tuần. Sản phẩm của công ty Dược phẩm Nam Khoa.
- Kit định lượng IgG, IL-2, TNF-α của Hãng Invitrogen, 542 Flynn- Camarillo, CA 93012 Mỹ.
- Kit định lượng ALT, AST và bilirubin do hãng Human cung cấp.
- Các dung môi hoá chất tiêu chuẩn phân tích (quy định của Dược điển Việt Nam IV).
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Nghiên cứu về thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa.
- Làm tiêu bản mẫu cây
- Thẩm định tên khoa học của cây trên cơ sở:
+ Phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với khoá phân loại thực vật [89], so sánh với các mẫu tiêu bản cây Ô đầu đang lưu tại Viện Dược liệu.
+ Lấy mẫu lá cây tươi để chiết và phân tích ADN, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen của loài thuộc chi Aconitum [15], [83].
* Tách chiết ADN tổng số:
ADN toàn phần được tách từ lá tươi theo quy trình tách chiết ADN DNeasy plant mini kits (QIAGEN, USA). ADN toàn phần được kiểm tra lại bằng phương pháp điện di trên gel agarose [53]
*Khuếch đại ADN bằng PCR:
Đoạn trình tự ADN mARN ITS1-5,8S-ITS2 được khuếch đại sử dụng cặp mồi ITS5 – GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG và ITS4 –
TCCTCCGCTTATTGATATGC
33
Chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR dự kiến: Khởi động nhiệt 94 oC trong 3
phút.Tiến hành 35 chu kỳ (Biến tính: 94 oC trong 1 phút + Bắt cặp: 54 o
C trong 1 phút + Khuếch đại: 72 oC trong 1 phút). Pha tổng hợp cuối cùng: 72 oC trong 8 phút. * Điện di ADN trên gel agarose
Nguyên tắc: Các đoạn ADN mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trường theo chiều từ cực âm sang cực dương. Trên bản gel agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường. Nhuộm ADN bằng Ethidium bromid để quan sát ADN dưới ánh sáng tử ngoại, bước sóng 254 nm.
Tiến hành: Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel. Chạy điện di ở điện thế 110 V. Sau đó nhuộm bản gel bằng Ethidium bromid, rửa sạch bằng nước cất rồi quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
* Phƣơng pháp tinh sạch ADN
Để tinh sạch ADN, sử dụng kit tinh sạch của hãng Fermentas (Đức) gồm các bước tiến hành như sau:
- Lấy 100 L đệm tách ADN, cùng với 100L ADN rồi trộn đều.
- Chuyển lên cột Genne JetTm. Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới
- Thêm 700 L đệm rửa để loại tạp chất. Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 2 phút, bỏ phần dịch bên dưới.
- Đặt cột vào trong ống 1.5 L. Cho 30L H2O vào cột sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 2 phút.
- Bảo quản ADN ở -20 đến -80 0 C
* Phƣơng pháp giải trình tự
Nguyên tắc: Dựa theo phương pháp Sanger cải tiến có sử dụng các dideoxynucleotid. Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Nhờ vậy tất cả các oligonucleotid cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotid sẽ có cùng một màu. Trình tự ADN được giải trình tự bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc) trên máy đọc trình tự tự động.
34
* So sánh trình tự ADN
Trình tự ADN của các mẫu được phân tích bằng phần mềm MEGA 6.0 và so sánh với ADN của loài thuộc chi Aconitum đã công bố trên genbank bằng công cụ NCBI/BLAST, công cụ này sẽ chỉ ra độ tương đồng của các gen giữa loài nghiên cứu với các công bố trước đây [146]
2.4.2. Nghiên cứu thành phần hoá học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ [1], [13], [20].
- Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp acid-base [6], [127]:
Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (Ô đầu, Phụ tử) hoặc một lượng phân đoạn D, E tương đương khoảng 10 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 250 ml. Thêm 50 ml hỗn hợp ether-cloroform (3:1) và 4 ml dung dịch amoniac. Đậy nắp, lắc kỹ để qua đêm, gạn lọc thu dịch. Lắc bã với 50 ml hỗn hợp trên trong 1 giờ, lọc thu dịch lọc. Rửa bã 3-4 lần nữa, mỗi lần 15ml hỗn hợp trên. Gộp dịch lọc và dịch rửa, bốc hơi cách thủy đến khô ở nhiệt độ thấp (60-65 0C). Cắn hòa tan bằng 5ml ethanol, thêm chính xác 15ml H2SO4 0.02N và 15ml nước cất mới đun sôi để nguội, 3 giọt chỉ thi đỏ methyl. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.02N đến khi xuất hiện màu vàng.
1 ml dung dịch H2SO4 0.02N tương đương với 12,9mg alcaloid toàn phần tính theo aconitin
Hàm lượng phần trăm alcaloid toàn phần được tính theo công thức: X% =
Trong đó:
- X %: là hàm lượng alcaloid toàn phần (tính trên mẫu khô tuyệt đối) - p: là khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (g)
- n : số ml dung dịch NaOH 0.02N tham gia phản ứng (ml) - Định lượng aconitin bằng phương pháp HPLC [11], [13], [75], [127]
- Định lượng flavonoid toàn phần và polysaccharid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến [28], [33], [36], [34], [58], [96], [97].
35
- Xác định hàm lượng các kim loại nặng trong mẫu Ô đầu, Phụ tử bằng phương pháp đo phổ ICP-MS [26]:
Quy trình xử lý mẫu dược liệu (Bột Ô đầu, bột Phụ tử khô) để xác định hàm lượng kim loại nặng: Cân 10.0368 g bột Ô đầu (10.0683 g bột Phụ tử) cho vào chén thạch anh, thêm chất phụ gia (16 ml H
2SO
4 45 % và 4g KNO
3), trộn đều, sấy khô, đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 400-450 oC, sau đó ở 550 oC, đến khi hết than đen, được tro mẫu trắng. Hoà tan tro thu được trong 30ml dung dịch HCl 18 % và 2 ml HNO
3 65 %, đun nhẹ cho mẫu tan hết, đun nhẹ làm bay hơi acid đến còn muối ẩm, hòa tan muối này trong dung dịch acid HCl 2 %, cho vào bình định mức 10 ml và thêm dung dịch acid HCl 2% đến vạch, đo trên máy ICP-MS xác định hàm lượng các kim loại nặng.
- Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột và theo dõi các phân đoạn bằng SKLM [1], [13], [14], [19], [44], [54, [68], [103] như sau:
+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60GF254
(Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol. + Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 0.040- 0.063 mm, 0.063-0.200 mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex G100
+ Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập dựa trên thông số vật lý và các phương pháp phổ gồm: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều [1], [13], [21], [30], [31], [32], [54], [72], [86], [101], [131].
2.4.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học
2.4.3.1.Thử độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của phân đoạn chứa alcaloid, phân đoạn chứa polysaccharid chiết từ Phụ tử và phân đoạn chứa flavonoid chiết từ lá cây Ô đầu, trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon và phương pháp BLISS [16], [128].
36
Chuột được chia thành các lô khác nhau. Cho chuột uống phân đoạn dịch chiết với liều tăng dần trong cùng một thể tích để xác định liều thấp nhất gây chết 100 % chuột và liều cao nhất không gây chết chuột (gây chết 0 % chuột).
Theo dõi tình trạng chung của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nôn, co giật, kích động…) và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc. Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc.
2.4.3.2. Nghiên cứu tác dụng giảm đau
+ Mẫu nghiên cứu: Phân đoạn dịch chiết từ Phụ tử chứa alcaloid + Phương pháp và cách thực hiện:
* Nghiên cứu tác dụng giảm đau trên mô hình “mâm nóng” (hot plate) [51], [136]
- Nguyên lý: Đánh giá tác dụng giảm đau thông qua khả năng đáp ứng với kích thích
nhiệt của chuột theo thời gian. Đặt chuột lên mâm nóng (máy Hot plate), luôn duy trì ở nhiệt độ 56 oC bằng hệ thống ổn nhiệt. Thời gian phản ứng với kích thích nhiệt được tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến khi chuột có phản xạ liếm chân sau. So sánh thời gian phản ứng với kích thích nhiệt trước và sau khi uống mẫu nghiên cứu và so sánh giữa các lô chuột với nhau.
- Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con: + Lô 1 (chứng): Uống nước cất liều 0.2 ml/10 g/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 2: Uống codein phosphat 20 mg/kg 1 lần trước khi đo lần thứ hai 1 giờ.
+ Lô 3: Uống MNC liều 12.5 mg (tương đương khoảng 8 g dược liệu)/kg TT/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 4: Uống MNC liều 25 mg (tương đương khoảng 16 g dược liệu)/kg TT/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 5: Uống MNC liều 50 mg (tương đương khoảng 32 g dược liệu)/kg TT/ngày trong 3 ngày.
Chuột ở các lô 1, 3, 4 và 5 được uống nước cất hoặc thuốc thử mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 3 ngày liên tục.
37
Đo thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột trước khi uống thuốc và sau khi uống thuốc lần cuối cùng 1 giờ.
* Nghiên cứu tác dụng giảm đau bằng máy tail-flick [136], [138]
- Nguyên lý: Đánh giá tác dụng giảm đau thông qua khoảng cách đau (tính từ lúc bắt
đầu tác động lực đến lúc chuột có phản ứng quay lại liếm đuôi) so sánh giữa lô chuột uống mẫu nghiên cứu với lô chứng. Phương pháp gây đau bằng máy tail-flick trên đuôi chuột nhắt trắng được thực hiện như sau:
+ Tác dụng một lực tăng dần lên đuôi chuột.
+ Khi đạt ngưỡng gây đau, chuột phản ứng lại bằng cách quay lại liếm vào đuôi ở vị trí gây đau hoặc rút đuôi ra khỏi kim gây đau.
+ Đo các chỉ số trước khi cho uống mẫu nghiên cứu
+ Sau 3 ngày, sau khi uống mẫu nghiên cứu liều cuối cùng 1 giờ, đo lại lần 2 như lần 1 (trước khi uống thuốc).
- Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con + Lô 1 (chứng): Uống nước cất liều 0.2 ml/10 g/ngày
+ Lô 2: Uống codein phosphat 20 mg/kg 1 lần trước khi đo lần thứ hai 1 giờ. + Lô 3: Uống MNC liều 12.5 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 4: Uống MNC liều 25 mg/kg/ngày trong 3 ngày. + Lô 5: Uống MNC liều 50 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
Chuột ở các lô 1, 3, 4 và 5 được uống nước cất hoặc thuốc thử mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 3 ngày liên tục. Đánh giá phản ứng của chuột trước khi uống mẫu nghiên cứu và sau khi uống mẫu nghiên cứu lần cuối cùng 1 giờ và so sánh lô chứng.
* Nghiên cứu tác dụng giảm đau trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic [52], [142]
- Nguyên lý: Dùng acid acetic 1 % tiêm màng bụng chuột để gây quặn đau và đếm số
cơn quặn đau trong mỗi 5 phút cho đến hết phút thứ 30 sau khi tiêm, so sánh số cơ quặn đau trong mỗi 5 phút của chuột giữa các lô uống mẫu nghiên cứu với lô uống nước cất, lô uống aspirin để đánh giá tác dụng của mẫu nghiên cứu.
38
- Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con: + Lô 1 (chứng): Uống nước cất liều 0.2 ml/10g/ngày trong 3 ngày. + Lô 2: Uống aspirin 150 mg/kg 1 lần trước khi đo lần thứ hai 1 giờ. + Lô 3: Uống MNC liều 12.5 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 4: Uống MNC liều 25 mg/kg/ngày trong 3 ngày. + Lô 5: Uống MNC liều 50 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
Chuột ở các lô uống nước cất hoặc mẫu nghiên cứu mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 3 ngày liên tục. Ngày thứ 3, sau khi cho chuột uống mẫu nghiên cứu 1 giờ, tiêm vào ổ bụng mỗi chuột 0.2 ml dung dịch acid acetic 1 % để gây quặn đau. Đếm số cơn quặn đau của từng chuột trong mỗi 5 phút cho đến hết phút thứ 30 sau khi tiêm acid acetic.
2.4.3.3. Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch
+ Mẫu nghiên cứu: Phân đoạn dịch chiết từ Phụ tử chứa polysaccharid
+ Nguyên lý: Gây suy giảm miễn dịch cấp bằng cyclophosphamid trên chuột nhắt bằng
cách tiêm màng bụng chuột cyclophosphamid (CY), liều duy nhất 200 mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch. Sau đó chuột được uống mẫu nghiên cứu, uống thuốc levamisol trong 7 ngày liên tục, đến ngày thứ 8 giết chuột để đánh giá tác dụng miễn dịch thông qua khả năng phục hồi miễn dịch dựa trên các chỉ số về miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào [5], [46], [74].
+ Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột thí nghiệm được chia thành 5 lô.
- Lô 1 (Chứng sinh học): Chuột không bị tác động gì (n=10) (uống nước cất). - Lô 2 (Tiêm CY): Chuột được tiêm CY, không điều trị (n=10).
- Lô 3 (Tiêm CY +levamisol): Chuột được tiêm CY, được uống levamisol liều 100 mg/kg (n=10).
- Lô 4 (Tiêm CY + PĐ polysaccharid): Chuột được tiêm CY, được uống PĐ Polysaccharid liều 100 mg/kg thể trọng chuột tương đương 3 g dược liệu/kg TT (n=10).
39
- Lô 5 (Tiêm CY + PĐ polysaccharid): Chuột được tiêm CY, được uống PĐ Polysaccharid liều 300 mg/kg thể trọng chuột tương đương 9 g dược liệu/kg TT (n=10).
Sau khi tiêm màng bụng cyclophosphamid liều 200 mg/kg ở các lô 2, 3, 4 và 5 vào ngày thứ 2 các lô chuột được uống nước cất và các thuốc liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8, giết chuột, lấy máu và các tổ chức lympho để làm xét nghiệm [10], [37].