Đối tượng nghiên cứu
- Ký sinh trùng: sán lá đơn chủ (Dactylogyrus sp.) - Cá trắm giống
Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Hóa chất
- Folmandehit
- Hóa chất, dung cụ và test để đo các yếu tố môi trường nước trong quá trình thí nghiệm.
Dụng cụ thí nghiệm
-Thước đo
- Cân điện tử
- Lưới lọc phù du với mắt lưới 15µm dùng để thu trứng - Kính hiển vi quang học
- Dụng cụ giải phẫu: kéo, kẹp, khay mổ, găng tay... - Đồng hồ
- Đĩa peptri, lamen,...
- Cốc thủy tinh, bình xịt để rửa và thu trứng, bể cá thủy tinh 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá
Thu mẫu cá
- Thu mẫu cá một cách ngẫu nhiên, mẫu vật phải còn sống.
- Bảo quản mẫu: mẫu sau khi được giữ trong túi nilon có bơm khí oxy để vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Quan sát ký sinh trùng từ cá
- Đặt cá lên khay, quan sát hình thái bên ngoài của cá, chú ý đến các biểu hiện bên ngoài như các vết loét, vết xuất huyết...
- Hủy não cá.
- Cạo nhớt trên thân cá phết lên lame, dùng kéo lần lượt cắt vây và các cung mang cho vào từng đĩa petri.
- Đặt từng cung mang lên lame, cạo nhớt mang, sau đó quan sát dưới kính hiển vi để tìm kí sinh trùng. Điều chỉnh độ phóng đại của kính từ thấp đến cao, với độ phóng đại 4x10 để phát hiện KST và 10x10 để quan sát chi tiết về hoạt động bơi lội,sinh sản.
3.3.2. Quan sát và xác định tốc độ đẻ trứng của sán lá đơn chủ (Dactylogyrus sp.) (Dactylogyrus sp.)
Cá sau khi được vận chuyển về phòng TN nếu kiểm tra thấy có KST là sán lá đơn chủ Dactylogyrus sp.với cường độ nhiễm cao thì ta tiến hành theo dõi sự sinh sản của sán trên 60 con cá trong 5 ngày đêm, mỗi ngày ta theo dõi 12
con. Còn nếu cá đưa về chưa có sán ta tiến hành gây nhiễm bằng cách gây bẩn nước nuôi cho nước phân lợn tạo điều kiện cho sán phát triển, sau đó bắt đầu tiến hành thí nghiệm Khi bắt đầu quan sát thấy sán hính thành bọc trứng, thì phải theo dõi liên tục đến khi quả trứng đầu tiên bắt đầu theo dõi sau khi cắt mang, dùng đồng hồ đếm để xác định thời gian giữa 2 lần đẻ trứng, ghi chép và thống kê kết quả từng sán từ lúc quan sát đến lúc sán hết năng lượng và chết.
Trong quá trình theo dõi sán đẻ dưới kính hiển vi, cần chú ý một số điểm sau đây:
Cắt mang ngay sau khi đưa ra khỏi bể nuôi,tiến hành kiểm tra và quan sát ngay sau khi cắt mang rời cơ thể cá vì sau khi cắt mang rời cơ thể ,sán có xu hướng bơi ra ngoài và có thể tồn tại và sinh sản trong thời gian ngắn.
Khi theo dõi sán đẻ cần liên tục dùng pipep nhỏ nước môi trường vào lam kính để tạo kích thích sán đẻ giống như tự nhiên trên mang cá (quá trình hô hấp mang sẽ tạo oxygen cung cấp cho sán), thường là phải thay nước trên lam kính liên tục 20%.
Vặn nhỏ cường độ ánh sáng của kính hiển vi trong quá trình theo dõi sán đẻ trứng tránh làm tăng nhiệt độ ở lam kính cũng là biện pháp tạo điều kiện thích hợp cho sán đẻ.
3.3.3. Xác định thời gian phát triển của trứng SLĐC Dactylogyrus sp.
- Nuôi giữ cá nhiễm SLĐC trong bình thủy tinh, chia làm 5 lô thí nghiệm.
- Hàng ngày tiến hành lọc nước xi phông đáy ở bình thủy tinh qua lưới lọc (có đường kính 15 µm) phần cặn đáy thu được cho vào đĩa peptry.
- Đưa đĩa peptry lên KHV để phát hiện trứng SLĐC Dactylogyrus sp..Sau đó tiến hành hút trứng vào đĩa lồng để ấp trứng ở điều kiện nhiệt độ phòng và thường xuyên thay nước sạch mỗi ngày 1 lần.
- Quan sát đĩa lồng hàng ngày để theo dõi quá trình biến thái của trứng SLĐC
Dactylogyrus sp., ghi lại thời gian trứng nở thành ấu trùng.
3.3.4. Xác định vòng đời của sán lá đơn chủ Dactylogyrus sp. nhiễm trên cá Trắm cỏ
Vòng đời của sán lá đơn chủ được xác định từ khi trứng được đẻ ra, phát triển nở thành sán ấu niên, sán ấu niên bơi lội tìm ký chủ và ký sinh trong một
thời gian và phát triển thành sán trưởng thành. Sán trưởng thành là thời điểm sán bắt đầu có khả năng sinh sản.
Để thực hiện thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành các bước sau: Bước 1: Tạo đàn cá sạch bệnh (không nhiễm Dactylogyrus sp.)
Để tạo đàn cá sạch bệnh chúng tôi thu thập mẫu cá trắm cỏ sạch bệnh bằng cách kiểm tra ngẫu nhiên 10-15 con từ nguồn mẫu, sau đó để chắc chắn cá thí nghiệm không có sán ký sinh, chúng tôi tiến hành tắm formaline (250ppm) trong thời gian 30 phút.
Bước 2: Thu trứng sán
Nuôi giữ cá bị nhiễm sán lá đơn chủ vào trong 2 bình thủy tinh tròn, mỗi bình 5 con. Mỗi ngày vào cuối buổi chiều ta đem xi phông nước ở tầng đáy bình đem lọc qua lưới vợt phù du( mắt lưới có đường kính 15µm), thu được phần cặn đáy ta soi qua kính hiển vi kiểm tra nếu thấy có nhiều trứng sán với mật độ dày ta tiến hành gây nhiễm cho lô cá đã chuẩn bị từ trước. Với mỗi 1 bể ta gây nhiễm 1 lần của 1 ngày thu.
Hình 3.1.Xi phông thu trứng sán qua lưới lọc 15µm Bước 3: Bố trí thí nghiệm
Bố trí 6 bể, mỗi bể 40 lít nước thả 30 con cá, 1 bể làm lô đối chứng( không gây nhiễm) còn 5 bể là lô thí nghiệm( gây nhiễm với trứng sán lá). Sục khí ở các bể để đảm bảo hàm lượng oxy cho cá phát triển bình
thường.Chúng tôi tiến hành kiểm tra môi trường nước ở bể nuôi định kì hàng ngày các thông số nhiệt độ, pH, độ mặn...
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Bước 4: Tiến hành gây nhiễm và theo dõi
- Gây nhiễm trứng sán lá mới sinh ra vào lô cá sạch.
- Sau ba ngày, kiểm tra sự xuất hiện của sán non bám trên mang cá (kiểm tra tất cả các mang của cá). Mỗi lần kiểm tra tiến hành trên 1con cá, nếu thấy trứng nở ở ngày hôm đó thì làm trên 5 con, ngày hôm sau lại kiểm tra trên 1 con, tương tự đến khi sán đẻ.
- Ghi nhận thời gian xuất hiện của sán, thời gian sán đẻ và chụp hình lại.
3.4.PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu và so sánh sử dụng phần mềm thống kê sinh học trên Excel 2007
Trường ĐHNN – Hà Nội Khoa CN & NTTS
Bố trí 6 bể, 30 con cá/bể
Lô đối chứng (1 bể) không gây nhiễm với trứng sán lá
(Dactylogyrus sp.)
Lô thử nghiệm (5 bể) gây nhiễm với sán lá (Dactylogyrus sp.)
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA CĐN, TLN SÁN LÁ ĐƠN CHỦ (Dactylogyrus sp.) TRÊN CÁ TRẮM CỎ
Trong quá trình thực tập chúng tôi tiến hành lấy mẫu cá Trắm cỏ 4 lần ở 4 khu vực lân cận Hà Nội. Sau mỗi lần lấy mẫu, chúng tôi kiểm tra ngẫu nhiên 30 mẫu cá để kiểm tra sơ bộ về tình hình nhiễm sán lá đơn chủ(Dactylogyrus sp.), kết quả được trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra CĐN, TLN sán lá đơn chủ trên cá Trắm cỏ (n=30)
Ngày lấy mẫu
Nơi lấy mẫu
Chiều dài (cm) ±SE Trọng lượng (g) ±SE Sán lá đơn chủ CĐN Sán/vi trường TLN 28/2 Mão Điền, Thuận Thành, Bắc Ninh 4,56±0.06 0,86±0,02 9,8±1,41 100% 2/3 Mão Điền, Thuận Thành, Bắc Ninh 6,70±0,15 2,82±0,18 5,63±1,36 100% 12/3 Trung tâm giống thủy sản Mê Linh, Hà Nội 6,28±0,17 2,66±0,11 7,6±0,89 100% 15/4 Từ Sơn, Bắc Ninh 4,77±0,11 1,36±0,13 1,27±0,15 7,4%
Trong quá trình thu mẫu, để thu được mẫu đang nhiễm sán lá đơn chủ chúng tôi đều mang theo hính hiển vi kiểm tra trước khi mang mẫu về nên hầu
hết các mẫu thu về đều nhiễm với tỷ lệ cao.Qua bảng 4.1 cho thấy trong 3 lần đầu thu mẫu TLN kí sinh trùng đều là 100% ở lần cuối thì tỉ lệ nhiễm thấp chỉ là 7,4%. Cá được chăm sóc cẩn thận và sau khoảng 2 ngày lấy mẫu về chúng tôi tiến hành theo dõi soi trên kính hiển vi, tránh cá chết gây thiệt hại.Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, chúng tôi thường xuyên kiểm tra các yếu tố môi trường và kết quả là: nhiệt độ: 25,33±0,41ºC, pH: 7,38±0,36, DO: 5,4±0,51. 4.2. XÁC ĐỊNH CHU TRÌNH THỜI GIAN SLĐC ĐẺ TRỨNG
Qua một quá trình theo dõi hoạt động của sán lá đơn chủ trên mang cá trắm trên kính hiển vi chúng tôi thấy rằng sau khi cắt mang khỏi cá thì hoạt động của sán lá đơn chủ vẫn khá ổn định. Sán di chuyển theo kiểu sâu đo trên mang cá dùng đầu móc hút chất dinh dưỡng, sau một thời gian tích lũy dinh dưỡng sán trưởng thành sẽ dần hình thành bọc trứng ở trong cơ thể.
Hình 4.1. Sán lá đơn chủ trưởng thành đang trong quá trình sinh sản
Dần dần sán sẽ di chuyển ra bên ngoài mang ở môi trường chất nhày kích thích đẩy trứng ra khỏi cơ thể. Tùy vào điều kiện kích thích bên ngoài như nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan sán sẽ tiếp tục đẻ sau 1 khoảng thời gian. Trong quá
Trường ĐHNN – Hà Nội Khoa CN & NTTS
Bọc trứng hình thành trong cơ thể
sán
trình quan sát chúng tôi nhận thấy sán thường chết nhanh sau khi cắt mang và cho lên kính hiển vi do ánh sáng và nhiệt độ cao.Để cái thiện môi trường giúp sán có thể sinh sản chúng tôi tiến hành một số biện pháp như dùng pipep để nhỏ nước môi trường cũ của cá lúc sống vào lamen chứa mang cá đã cắt và liên tục thay nước mới đều đặn 1 phút/lần (cần chú ý nhỏ giọt bé để tránh gây trôi mất sán đang theo dõi). Việc làm trên vừa giúp tạo điều kiện giống trong mang đang hô hấp bằng cách đẩy nước ra vào cũng như tăng hàm lượng oxy hòa tan trong nước. Nhiệt độ cũng gây kích thích khá mạnh cho sán đẻ trứng, vì vậy khi soi kính hiển vi ta nên giảm bớt cường độ chiếu sáng của đèn kính. Càng tối thì sán hoạt động càng tốt, chỉnh sao cho vừa đủ nhìn và có những khoảng thời gian nghỉ ta tắt kính để giảm hẳn nhiệt độ.
Bảng 4.2: Tốc độ sinh sản của sán lá đơn chủ Dactylogyrus sp. theo dõi
trong 5 ngày từ khi sán bắt đầu đẻ trứng
Ngày Tổng lượng mẫu cá theo dõi Tổng số sán quan sát Số trứng/lần theo dõi Tốc độ đẻ (phút/trứng) Ngày 1 6 29 1,83 ± 0,31 15,31 ± 0,33 Ngày 2 6 44 3,17 ± 0,31 13,9 ± 0,31 Ngày 3 6 50 4,17± 0,31 12,73±0.24 Ngày 4 6 67 4,67±0,33 11,34 ± 0,38 Ngày 5 6 78 5.83± 0,31 10,51± 0,22
Sau 5 ngày theo dõi sán lá đơn chủ đẻ tính từ ngày sán bắt đầu đẻ trứng (hình 4.3 và 4.4), thời gian theo dõi được cố định từ 7-9h sáng hàng ngày, chúng tôi nhận thấy ở những ngày đầu sán vẫn còn ở giai đoạn còn non chỉ một số ít đã đến tuổi thành thục nên chỉ theo dõi được ít trứng được sinh ra, cụ thể trong 2 ngày đầu trong mỗi lần theo dõi sán chỉ đẻ từ 1-3 trứng, khoảng thời gian giữa hai lần đẻ gần nhau trung bình 14-15 phút/trứng. Ở những ngày sau sán ký sinh trên cá hầu như đã đạt đến thời kì trưởng thành do đó số lượng trứng tăng dần
qua từng ngày, đồng thời tốc độ đẻ tăng lên trong cùng 1 đơn vị thời gian. Cụ thể tốc độ đẻ là trung bình 15,31 trứng/phút ở ngày thứ nhất xuống chỉ còn trung bình 10,51 trứng/phút ở ngày thứ 5 (bảng 4.2). Vì tách mang, ảnh hưởng đến dinh dưỡng của sán, nên hầu hết sán chỉ tồn tại trong khoảng 1 giờ sau khi cắt khỏi cơ thể cá, do vậy lượng sán đẻ ở kết quả bảng 4.2 được theo dõi từ khi bắt đầu quan sát đến khi sán chết.
Hình 4.2: Sán đẻ trứng Hình 4.3: Sán hình thành bọc trứng trong cơ thể ở lần đẻ tiếp theo
Tốc độ đẻ trứng của SLĐC giảm đồng thời số trứng tăng dần qua 5 ngày được thể hiện qua biểu đồ 4.3.
Biểu đồ 4.3. Tốc độ đẻ và số trứng củaDactylogyrus sp.vào ban ngày
Trong quá trình theo dõi, để so sánh tốc độ và sức đẻ trứng của sán giữa ngày và đêm, chúng tôi tiến hành quan sát sán lá đơn chủ đẻ lúc nửa đêm. Quy trình theo dõi giống hệt quy trình theo dõi ban ngày. Kết quả tốc độ sinh sản của SLĐC vào ban đên được thể hiện ở bảng 4.4.
Bảng 4.4.Tốc độ sinh sản của sán lá đơn chủ Dactylogyrus sp. theo dõi trong 5 đêm từ khi sán bắt đầu đẻ trứng
Thời gian Số lượng mẫu cá theo dõi Số lượng sán theo dõi Số trứng/ lần theo dõi Tốc độ đẻ trứng (trứng/phút) Đêm 1 6 38 3,67± 0,33 8,25±0,26 Đêm 2 6 47 5,67± 0,33 7,20±0,23 Đêm 3 6 58 7,67± 0,33 6,07 ± 0,10 Đêm 4 6 59 7,83 ± 0,31 5,05 ± 0,14 Đêm 5 6 77 11,54 ± 0,32 4,04 ± 0,08
Qua bảng 4.4, chúng tôi nhận thấy số lượng trứng tăng lên theo từng đêm, từ 3,67 trứng/lần theo dõi ở đêm thứ nhất sau khi sán bắt đầu sinh sản lên 11,54 ở đêm thứ 5. Đồng thời tốc độ đẻ trứng của SLĐC khá nhanh và tăng dần theo thời gian từ 8,25 phút/trứng ở đêm đầu tiên chỉ còn khoảng 4 phút/trứng ở đêm thứ 5.
Khi so sánh tốc độ đẻ giữa ngày và đêm, chúng tôi nhận thấy vào đêm sán đẻ nhiều hơn ban ngày (biểu đồ 4.5) , cường độ sán đẻ cũng cao hơn đặc biệt tốc độ sán đẻ càng cao vào lúc nửa đêm (22h – 2h sáng) (biểu đồ 4.6). Điều này có thể là do khả năng sinh tồn và bảo vệ nòi giống của sán lá đơn chủ (Monogenea), theo Truong Dinh Hoài và Kate Hutson (2013), sán lá đơn chủ có xu hướng đẻ nhiều vào ban đêm có thể tránh được các con mồi trong môi trường nước.
Biểu đồ 4.5: So sánh số trứng/lần theo dõi của SLĐC giữa ngày và đêm
Biểu đồ 4.6: So sánh tốc độ đẻ trứng của SLĐC giữa ngày và đêm
Dựa vào 2 biểu đồ ta thấy vào ban đêm sán đẻ trứng gấp 1,7 - 2 lần biểu đồ 4.5) so với ban ngày và tốc độ đẻ cũng nhanh hơn vào ban đêm từ 1,9 – 2,5 lần (biểu đồ 4.6).
Sau khi tổng hợp số liệu có thể xác định sán đẻ trứng trung bình trong khoảng 7 - 12 phút/1 lần. Theo kết quả nghiên cứu của Trương Đình Hoài và Kate Hutson sán lá đơn chủ Neobenedenia có thể sinh sản từ 66 trứng/ ngày ở ngày sán bắt đầu sinh sản và tăng lên đến gần 500 trứng ở ngày thứ 6 theo dõi. Tuy nhiên trong điều kiện nghiên cứu của chúng tôi, sán lá đơn chủ đẻ 2-5 trứng rồi chết do thiếu chất dinh dưỡng cung cấp, oxy hòa tan trong nước thiếu để cung cấp năng lượng cho sán. Do vậy chúng tôi chưa thể dự đoán về tổng số lượng trứng có thể đẻ trong 1 ngày và trong quá trình sinh sản của sán.
4.3. THỜI GIAN SINH TRƯỞNG CỦA SÁN LÁ ĐƠN CHỦ
4.3.1. Xác định các giai đoạn phát triển của Dactylogyrus sp.
Các yếu tố thủy hóa: kết quả kiểm tra các yếu tố thủy hóa được ghi nhận ở bảng cho thấy các giá trị nhiệt độ, pH, COD, NH3 đều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của cá.
Bảng 4.7: Giá trị các yếu tố thủy hóa
Thời điểm Các chỉ tiêu
Nhiệt độ pH COD (mg/l) NH3 (mg/l)
Trước thí nghiệm 25 - 27ºC 7,3- 7,4 2,80- 2.85 0,0- 0,0
Sau thí nghiệm 25 - 27ºC 7,6- 7,8 4,85- 5,87 0,5- 0,8
Các giai đoạn của sán lá đơn chủ (Dactylogyrus sp.)
Sau qua trình theo dõi và quan sát dưới kính hiển vi, chúng tôi đã xác định thời gian hoàn thành vòng đời của sán lá đơn chủ (Dactylogyrus sp.) và các giai đoạn cụ thể như sau: