Tiến hành hai thí nghiệm độc lập như sau:
Thí nghiệm 1: Lấy vào lọ sắc kí chất chuẩn m-TFMPP 500ppb và docosan 0,1 mg/ml. Tiến hành phân tích ở điều kiện tối ưu đã khảo sát.
Thí nghiệm 2: Lấy vào ống nghiệm có nắp 5ml m-TFMPP 500ppb, 1ml NaOH 25%, 5ml CHCl3, 0,5ml Docosan 1mg/ml. Lắc xoáy 30 phút, để phân lớp trong 5 phút. Lấy dịch chiết vào lọ và tiến hành phân tích trên thiết bị GC- MS ở điều kiện tối ưu.
Mỗi thí nghiệm làm lặp lại 3 lần và lấy trung bình. Kết quả được trình bày trên bảng 3.2.3.
Bảng 3.2.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết
Thí nghiệm (TN) STFMPP SIS STFMPP/ SIS TN1 65915654 9896911 6,660 TN2 – Chiết lần 1 62206461 9518557 6,535 TN2 – Chiết lần 2 - - - TN2 – Chiết lần 3 - - - H (%) 98,1
Ghi chú: Dấu “-” Tín hiệu nằm dƣới giới hạn phát hiện của thiết bị.
Kết quả thí nghiệm chiết với tỉ lệ 1:1 cho thấy: Hiệu suất chiết m- TFMPP khá cao (98,1%). Nói cách khác, kết quả chiết đáp ứng yêu cầu của phân tích định tính và định lượng.
3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của thiết bị:
Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của thiết bị, chúng tôi tiến hành đo lặp lại của cùng một mẫu có hàm lượng m- TFMPP là 125 ppb. Kết quả tính LOD và LOQ được trình bày trên bảng 3.2.4 sau đây:
Bảng 3.2.4. Kết quả đo lặp lại của mẫu m-TFMPP 125 ppb STT STFMPP SIS STFMPP/ SIS LOD (ppb) LOQ (ppb) 1 9443758 14683890 0,64314 0,22 0,72 2 10973519 14998349 0,73165 3 9749785 15732738 0,61971 4 8762473 11141599 0,78646 5 8460610 11251000 0,75199 TB 9478029 13561515 0,70659 SD 0,07184
Kết quả thu được cho thấy, thiết bị có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối nhỏ: LOD = 0,22 ppb, LOQ = 0,72 ppb.
3.3. Phƣơng pháp định lƣợng m-TFMPP: 3.3.1. Phƣơng trình hồi qui tuyến tính:
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn TFMPP có nồng độ thay đổi. Thêm một lượng nhất định nội chuẩn Docosan và tiến hành phân tích trên thiết bị GC- MS ở điều kiện tối ưu đã chọn. Làm lặp lại 3 lần và lấy trung bình, kết quả được trình bày trên bảng 3.3.1 và hình 3.3.1 sau đây:
Bảng 3.3.1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính xác định m-TFMPP
[TFMPP] ppb STFMPP SIS STFMPP/ SIS 100 9448029 13561515 0,697 125 12841733 16957812 0,757 250 32073949 16545743 1,939 500 53185121 15116262 3,518 1000 97765482 13673455 7,150 2000 213673688 15735697 13,579
0 500 1000 1500 2000 0 2 4 6 8 10 12 14
Linear Regression for Data1_B: Y = A + B * X
Parameter Value Error t-Value Prob>|t| --- A 0.09856 0.10762 0.91575 0.41161 B 0.0068 1.141E-4 59.6379 <0.0001 ---
R R-Square(COD) Adj. R-Square Root-MSE(SD) N --- 0.99944 0.99888 0.9986 0.18765 6 --- ST FM PP /S IS [TFMPP] ppb Hình 3.3.1. Đƣờng chuẩn xác định m-TFMPP
Phương trình hồi qui có dạng y = (a ± t.Sa) + (b ± t.Sb).x Với t(0,95; 4) = 2,78 phương trình hồi qui đầy đủ là:
y = (0,0986 ± 0,2992) + (0,0068 ± 0,0003).x (ppb)
Kết quả phân tích cho thấy, hằng số a của phương trình hồi qui dạng: y = a + bx có giá trị Pvalue = 0,4116 > 0,05 nên với mức độ tin cậy 95%, giá trị hằng số a khác 0 không có nghĩa thống kê, ta có thể bỏ qua giá trị này bên cạnh các hệ số còn lại, phương pháp không mắc sai số hệ thống.
3.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp:
Mẫu viên nén được chuẩn bị như mục 2.2.1 và tiến hành chiết tách ở các điều kiện tối ưu đã khảo sát như mục 2.3.2 trên 6 thí nghiệm độc lập. Kết quả thí nghiệm và tính toán LOD, LOQ được trình bày như bảng 3.3.2.
Bảng 3.3.2. Kết quả xác định LOD, LOQ của phƣơng pháp: STT STFMPP SIS STFMPP/ SIS b 3.S LOD D (ppb) b 10.S LOQ D (ppb) 1 62054798 15803652 3,9266 22,3 74,4 2 64967087 16081938 4,0398 3 54461615 13668518 3,9845 4 46167257 11466023 4,0264 5 47132408 12038272 3,9152 6 42327562 10639169 3,9785 TB 3,9785 SD 0,0506
Kết quả tính toán cho ta thấy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp lần lượt là 22,3 ppb và 74,4 ppb. Do vậy, để phân tích định lượng được m-TFMPP trên thiết bị GC-MS bằng phương pháp này thì nồng độ m-TFMPP trong mẫu tối thiểu phải ≥ 74,4 ppb.
3.3.3. Đánh giá tính phù hợp của phƣơng pháp:
Để đánh giá độ chính xác của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm độc lập ở điểm đầu và điểm cuối của đường chuẩn. Sau khi tính toán theo công thức .100%
X S
%RSD D (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phƣơng pháp: STT 100 ppb 2000 ppb tR STFMPP SIS STFMPP/SI S tR STFMPP SIS STFMPP/SI S 1 6,124 11173519 15998349 0,6984 6,134 219897027 16447636 13,3695 2 6,128 9324957 13724178 0,6795 6,137 203072360 14942154 13,5906 3 6,130 12052428 17574092 0,6858 6,132 190665849 13959595 13,6584 4 6,132 11753342 17168732 0,6846 6,123 190689943 14082484 13,5409 5 6,122 7293462 10373170 0,7031 6,129 184502232 13035404 14,1539 TB 6,127 0,6903 6,131 13,6627 SD 0,00415 0,00999 0,00534 0,29466 RSD (%) 0,068 1,45 0,087 2,16
Kết quả phân tích cho thấy: Chất phân tích có thời gian lưu xác định. m-TFMPP cho hai giá trị RSD rất nhỏ: RSD thời gian lưu và RSD tỉ lệ diện tích pic so với nội chuẩn ở điểm đầu và điểm cuối của đường chuẩn đều nhỏ hơn 5%. Như vậy hệ thống sắc kí phù hợp, phương pháp có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu của phân tích định tính và định lượng.
3.3.4. Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp:
Tiến hành ba thí nghiệm độc lập sau:
Thí nghiệm 1: Mẫu viên nén chứa thành phần TFMPP được chuẩn bị như mục 2.2.1. Lấy vào ống nghiệm có nắp các hóa chất sau: 5ml mẫu phân tích, 1ml NaOH 25%, 5ml Cloroform, 0,5ml Docosan 1mg/ml. Lắc xoáy 30 phút, để phân lớp trong 5 phút. Lấy dịch chiết vào lọ sắc kí và phân tích trên thiết bị GC-MS ở các điều kiện tối ưu đã khảo sát.
Thí nghiệm 2: Lấy vào ống nghiệm có nắp 5ml dung dịch mẫu phân tích, 1ml NaOH 25%, 5ml Cloroform, 0,5ml Docosan 1mg/ml và thêm chính xác m-TFMPP sao cho có nồng độ 250ppb. Lắc xoáy 30 phút, để phân lớp trong 5 phút. Lấy dịch chiết vào lọ sắc kí và phân tích trên thiết bị GC-MS ở các điều kiện tối ưu đã khảo sát.
Thí nghiệm 3: Làm tương tự thí nghiệm 2 nhưng thêm chính xác lượng chất chuẩn sao cho nồng độ m-TFMPP là 1500ppb. Mỗi thí nghiệm làm lặp lại 3 lần và lấy trung bình. Kết quả được trình bày trên bảng 3.3.4 sau đây:
Bảng 3.3.4. Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp trên nền mẫu thật
[TFMPP] thêm vào (ppb) STFMPP SIS STFMPP/SIS [TFMPP] tìm được (ppb) H (%) 0 30752238 16822520 1,8280 254,3 37065083 19782094 1,8737 261,0 35035843 19056786 1,8385 255,9 250 47167257 13466023 3,5027 500,6 95 42132408 12038272 3,4999 500,2 39327562 11639169 3,3789 482,4 1500 191131565 15936153 11,9936 1749,3 96 247235388 21122662 11,7047 1706,8 235883788 21016964 11,2235 1636,0
Từ kết quả thu được ta nhận thấy, với mức độ tin cậy 95% phương pháp có độ thu hồi tốt. Do đó, các kết quả phân tích được hoàn toàn tin cậy.
3.3.5. Quy trình giám định m-TFMPP trên thiết bị GC-MS:
Trên cơ sở các điều kiện tối ưu đã khảo sát, các kết quả phân tích cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, đáp ứng được yêu cầu của phân tích định tính và định lượng. Do vậy, chúng tôi đưa ra quy trình giám định định tính và định lượng m-TFMPP trong mẫu viên nén trên thiết bị GC-MS như sau:
1. Xử Lý mẫu: mẫu viên nén được xử lý theo sơ đồ hình 3.3.5.
Bước 1: Đồng nhất hoá mẫu Nghiền thành bột, trộn đều
Thêm HCl loãng 0,1M (1mg bột/1ml) Bước 2: Hoà tan mẫu Lắc siêu âm 30phút
Lọc bỏ phần không tan
Bước 3: Kiềm hóa dịch lọc Thêm NaOH 25% ( pH > 12) Thêm Docosan (1mg/1ml)
(tỷ lệ thể tích Docosan với Dịch lọc 1: 10 )
Thêm Cloroform (tỷ lệ thể tích 1:1) Bước 4: Chiết xuất Lắc xoáy 30 phút, để phân lớp 5 phút
Ly tâm 5 phút ở 3000 vòng/phút Hút lấy pha dung môi, lấy 1ml
Hình 3.3.5. Sơ đồ quy trình chiết m-TFMPP trong mẫu viên nén.
Viên nén m-TFMPP
Dịch lọc
Dịch lọc kiềm
Phân tích trên thiết bị GC-MS ở điều kiện tối ưu
Bột viên
2. Nhận dạng trên thiết bị:
- Điều kiện tối ưu trên GC-MS. Loại khối phổ sử dụng: Tứ cực. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cột Rtx-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) Chế độ chạy EI +
(Electron Impact). Kiểu va chạm điện tử ở điện thế 70 ev. Chế độ MS: full Scan. Khoảng m/z: 40-500.
Chế độ MS: SIM ( m/z: 43, 44, 57, 58, 72, 91, 134, 135, 142, 180, 182, 188, 230).
Điều kiện GC: Khí mang heli, tốc độ dòng 1,2 ml/phút. Lò sắc kí: 80o C giữ 0,5 phút, tăng 20o
C/ phút đến 170oC, giữ 1 phút, tăng 15oC/phút đến 270oC giữ đẳng nhiệt 3 phút. Tổng chương trình sắc kí 15,7 phút.
Điều kiện MS: nhiệt độ Transferline: 2800 Các mảnh ion TFMPP : 230 (M+ ), 189, 188, 173, 172, 145, , 85, 57, 56. Ion target: 188, 145, 230. Các mảnh Docosan ( C22H46 ) : 310(M+),176, 134, 91, 85, 71, 57, 43. Ion target: 57, 71, 85, 43, 310. - Đọc kết quả phân tích.
Việc xây dựng và tính kết quả được thực hiện dựa trên phần mềm (Xcalibul ) của thiết bị.
3.4. Ứng dụng:
Các mẫu viên nén chứa thành phần m-TFMPP được chuẩn bị và phân tích như sơ đồ hình 3.3.5. Kết quả thu được như bảng 3.4 sau đây:
Bảng 3.4. Kết quả định lƣợng trên GC-MS một số mẫu thực tế
Đặc điểm, logo Hình ảnh viên Số vụ án, khối lượng TB viên (mg) STFMPP SIS STFMPP/SIS mTFMPP trong viên (mg), Phần trăm % Chữ C màu hồng 2549 298 mg 19829666 11668518 1,6994 235,4 79 % Mào gà màu vàng 1955 M1 303 mg 8934149 12466023 0,7167 90,9 30 % Đầu chuột màu trắng 1955 M2 297 mg 7264616 12038272 0,6035 74,3 25 % Hai trái tim lồng, màu hồng 2287 306 mg 17615929 11639169 1,5135 208,1 68 % Hai trái tim lồng, màu đỏ 132 292 mg 13933738 14942154 0,9325 122,6 42 % Chữ M màu hồng 2008 335 mg 23418766 12959595 1,8071 251,3 75 % Không logo màu hồng 2008 306 mg 20003079 11982484 1,6694 231,0 75 %
3.5. Dẫn xuất hóa m-TFMPP:
3.5.1. Nguyên tắc dẫn xuất hóa m-TFMPP:
m-TFMPP là hợp chất dị vòng. Trong vòng của phân tử m-TFMPP có chứa hai nguyên tử N. Do vậy, trên sắc kí đồ quan sát thấy chân pic luôn luôn bị kéo vết. Điều đó gây khó khăn trong việc định tính cũng như định lượng m- TFMPP. Trên cơ sở đó, nhiều tác giả đã nghiên cứu đến việc dẫn xuất hóa m- TFMPP để tăng độ nhạy trong việc định tính và định lượng m-TFMPP [9, 11, 22].
Phản ứng dẫn xuất hóa xảy ra theo cơ chế thế nguyên tử hydro linh động của m-TFMPP với nhóm trifluoro acetic axit để tạo thành chất dẫn xuất m-TFMPP-TFA theo phương trình phản ứng sau:
Hình 3.5.1 Sơ đồ phân mảnh của TFMPP-TFA
3.5.2. Định tính lƣợng vết m-TFMPP:
Đối với công tác giám định, để phục vụ cho điều tra, việc phân tích định tính và định lượng các chất ma túy rất quan trọng. Nếu như phân tích định lượng để định khung hình phạt thì phân tích định đính để tìm ra dấu vết phục vụ cho điều tra phá án. Do đó, bên cạnh việc định tính, định lượng m- TFMPP, chúng tôi bước đầu nghiên cứu định tính lượng vết m-TFMPP.
Tiến hành thí nghiệm như sau: Lấy vào ống nghiệm 1ml m-TFMPP 100 ppb, thổi khô bằng dòng khí N2, thêm 200μl Etylacetat. Lắc xoáy 1 phút với tốc độ 1500 vòng/phút, thêm 200μl dung dịch TFA và lắc xoáy trong 2 phút với tốc độ 1500 vòng/phút. Việc chuyển hóa được thực hiện ở 700C trong thời gian 1 giờ trên dụng cụ gia nhiệt. Hỗn hợp sau phản ứng được sấy bằng dòng khí N2 đến khô, thêm 1ml Etylacetat, lắc xoáy 1 phút, sau đó phân tích trên GC-MS ở các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên. Kết quả như sau [13,20].
Hình 3.5.2.1. Sắc kí đồ của m-TFMPP chƣa dẫn xuất Thời gian lƣu của m- TFMPP là 6,12 phút,
Hình 3.5.2.2. Phổ khối của m-TFMPP khi chƣa dẫn xuất
Hình 3.5.2.3. Sắc kí đồ m-TFMPP dẫn xuất hóa thành m-TFMPP-TFA Thời gian lƣu của m- TFMPP-TFA là 7,68 phút
Hình 3.5.2.4. Phổ khối của m-TFMPP dẫn xuất hóa thành m-TFMPP-TFA
Kết quả phân tích cho thấy: Thí nghiệm dẫn xuất hóa đã thành công. Chúng tôi đã chuyển được lượng m-TFMPP thành m-TFMPP-TFA. Trên sắc kí đồ cho pic rõ nét, chân pic không kéo vết như khi chưa dẫn xuất. Do vậy, việc gắn một nhóm cấu trúc vào phân tử m-TFMPP thành công đã tạo tiền đề để tăng độ nhạy, độ chính xác trong phân tích định tính, định lượng m- TFMPP sau này.
3.5.3. Độ nhạy của phƣơng pháp sau khi dẫn xuất hóa:
Lấy vào ống nghiệm 1ml m-TFMPP 10 ppb, 100µl Docosan 1mg/ml, thổi khô bằng dòng khí N2, thêm 200μl Etylacetat. Lắc xoáy 1 phút với tốc độ 1500 vòng/phút, thêm 200μl dung dịch TFA và lắc xoáy trong 2 phút với tốc độ 1500 vòng/phút. Giữ nhiệt ở 700C trong thời gian 1 giờ trên dụng cụ gia nhiệt. Hỗn hợp sau phản ứng được sấy bằng dòng khí N2 đến khô, thêm 1ml Etylacetat, lắc đều và đem phân tích trên GC-MS ở các điều kiện tối ưu đã chọn. Kết quả được thể hiện trên hình 3.5.3 sau đây.
Hình 3.5.3. Sắc kí đồ, và phổ khối của m-TFMPP-TFA ở nồng độ 10ppb
Như vậy, bằng cách dẫn xuất hóa chúng tôi có thể phát hiện được m- TFMPP ở dưới giới hạn phát hiện của phương pháp. Điều này có ý nghĩa rất lớn đối với công tác điều tra, khám nghiệm hiện trường.
KẾT LUẬN
Từ kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu xây dựng được quy trình giám định m-TFMPP bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ như sau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1. Đã tìm được điều kiện tối ưu trên thiết bị GC-MS để định tính và định lượng m-TFMPP:
Loại khối phổ sử dụng: Tứ cực.
Cột Rtx-5MS (30m x 0,25mm x 0,25µm) Chế độ chạy EI +
(Electron Impact). Kiểu va chạm điện tử ở điện thế 70 ev. Chế độ MS: full Scan. Khoảng m/z: 40-500.
Chế độ MS: SIM( m/z: 56, 57, 72, 85, 91, 134, 135, 145, 176, 180, 182, 188, 230, 310).
Điều kiện GC: Khí mang heli, tốc độ dòng 1,2 ml/phút. Lò sắc kí: 80o C giữ 0,5 phút, tăng 20o
C/ phút đến 170oC, giữ 1 phút, tăng 15oC/phút đến