1. 2M ục tiêu của đề t ài
4.5Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa
4.5.1 Hình thái vi khuẩn
Qua kết quả nhuộm gram cho thấy, các chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc nhỏ li ti, hình tròn, màu trắng trong và khuẩn lạc nhỏ, hình tròn, màu trắng đục có dạng hình cầu, song cầu, liên cầu, tụ cầu. Còn các chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc to, hình tròn, màu vàng kem có dạng hình que, sinh bào tử (Hình 4.5). Nhìn chung các chủng vi khuẩn hình cầu đều không di động, riêng chủng hình que di động mạnh (Phụ lục 1).
Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn. A: vi khuẩn Gram âm (-), hình que ngắn và sinh bào tử. B: vi khuẩn Gram dương (+), dạng tụ cầu. C: vi khuẩn Gram dương (+), dạng đơn cầu và song cầu. D: vi khuẩn Gram dương (+), dạng liên cầu. (100X)
4.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Các chỉ tiêu cơ bản Các chỉ tiêu cơ bản
Qua 3 đợt thu và phân tích mẫu đã phân lập được 92 chủng vi khuẩn, các chủng vi khuẩn đều được kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý cơ bản như nhuộm gram, kiểm tra tính di động, oxidase, catalase, O/F. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý của 92 chủng vi khuẩn, thì có 89 chủng hình cầu, gram dương, không di động, tất cả đều cho kết quả Oxidse và O/F âm tính (Hình 4.6). Trong số 89 chủng vi khuẩn có 9 chủng chỉ tiêu Catalase dương tính và còn lại là âm tính. Còn 3 chủng vi khuẩn trong số 92 chủng cho kết quả gram âm, hình que, di động mạnh,OF dương tính, Oxidase và Catalase dương tính (Phụ lục 1).
D C
B A
Hình 4.6 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu OF
Khả năng phát triển ở 6,5% NaCl và tạo Nitrit từ Nitrat
Sau khi thu được kết quả phân lập và kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản, 20 chủng vi khuẩn đặc trưng đại diện cho 3 đợt thu mẫu (Phụ lục 2) được chọn để kiểm tra khả năng phát triển của chúng trên môi trường TSB có bổ sung 6,5% NaCl và khả năng biến đổi nitrat thành nitrit. Kết quả thu được 5 chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường TSB có bổ sung 6,5% NaCl, ủ ở 30-320C trong 48 giờ. Đồng thời cũng thu được 3 chủng vi khuẩn phản ứng với thuốc khử nit 1 và nit 2 cho màu nâu đỏ, có nghĩa là 3 chủng vi khuẩn có khả năng biến đổi nitrat thành nitrit (Bảng 4.2 và Hình 4.7).
Hình 4.7 Kết quả test muối 6,5% và Nitrat. A: Hình bên trái vi khuẩn không phát triển, bên phải vi khuẩn phát trển trong môi trường TSB (+6,5%NaCl). B: Phản ứng Nitrit với thuốc thử A & B. C: Vi khuẩn không tạo nitrit nên không có phản ứng nitrit với thuốc thử A & B
Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 20 chủng vi khuẩnđại diện
STT Chủng Nhuộm Gram
Di
Động Oxidase Catalase O F Nitrat
6,5% NaCl
1 B3K1F2-T Gram (+), hình cầu - - - - - - +
2 A2F7-T Gram (+), hình cầu - - - - + - -
3 B1K2F1-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
4 A2F1-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
5 A2F3-T Gram (+), hình cầu - - - - - - +
6 A1F2-T Gram (+), hình cầu - - - - - + -
7 A1F1-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
8 B3F2-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
9 A2F2-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
10 F7-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
11 B1K2F4-T Gram (+), hình cầu - - - - - + +
12 B1K2F5-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
13 B1K2F3-T Gram (+), hình cầu - - - - - + -
14 A2F2-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
15 A3F5-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
16 B2F2-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
17 B1F1-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
18 A2F4-T Gram (+), hình cầu - - - - - - +
19 F8-T Gram (+), hình cầu - - - - - - -
20 F10-T Gram (+), hình cầu - - - - - - +
Khả năng tan huyết
Cấy 20 chủng vi khuẩn đặc trưng lên môi trường Blood agar (+1,5% NaCl), ủ ở 35oC sau 48 giờ quan sát thấy các khuẩn lạc phát triển tốt. Hình dạng khuẩn lạc to tròn, kích thước lớn hơn so với phát triển trên môi trường TSA (+1,5% NaCl), ủ ở 30-32oC trong 48 giờ. Khuẩn lạc của vi khuẩn to tròn, lồi trên mặt môi trường và đĩa môi trường không thay đổi về màu sắc. Như vậy các chủng vi khuẩn thử nghiệm không có khả năng gây tan huyết (Hình 4.8).
Hình 4.8 Kết quả tan huyết. A và B: kết quả thu được sau 48 giờ
Kết quả kiểm tra bằng kít API 20 Strep
Có 10 chủng vi khuẩn được kiểm tra chỉ tiêu sinh hóa bằng kit API 20 Strep ở nhiệt độ 35-37oC. Kết quả ghi nhận các chỉ tiêu sinh hóa được trình bày ở phụ lục 3. Căn cứ vào kết quả và theo tài liệu định danh của Buller (2004) đã định danh được 5 loài vi khuẩn: Streptococcus iniae (với 5 chủng vi khuẩn phân lập được A1F1, A2F1, A2F2, B3F2, F7 chiếm 50% trong tổng số 10 chủng vi khuẩn đại diện), Streptococcus agalactiae (chủng vi khuẩn A2F7 chiếm 10% trong tổng số 10 chủng đại diện), Streptococcus phocae (2 chủng vi khuẩn A1F2 và A2F3 chiếm 20% trong tổng số 10 chủng đại diện), Lactococcus raffinolactis (chủng vi khuẩn B1K2F1 chiếm 10% trong tổng số 10 chủng đại diện), Enterrococcus faecium ( chủng vi khuẩn B3K1F2 chiếm 10% trong tổng số 10 chủng đại diện ).
a) Streptococcus iniae ( chủng vi khuẩn A1F1, A2F1, A2F2, B3F2, F7)
Mẫu cá phân lập được loài vi khuẩn Streptococcus iniae có các dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết vây bụng, vây ngực, vây hậu môn, vây đuôi, quanh cuống đuôi và bụng, xoang bụng chứa dịch và gan xuất huyết (Hình 4.9). Là nhóm vi khuẩn gram dương, hình cầu, không di động, O/F âm tính, khuẩn lạc có màu
trắng, hình tròn, kích thước nhỏ, Oxidase và Catalase âm tính, không phát triển trên môi trường TSB (+6,5% NaCl), không có khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit. Theo Bùi Quang Tề (2006) vi khuẩn Streptococcus ininae gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi thâm canh, cá bị bệnh thường gây hoại tử gan, lá lách và thận thành những đốm màu nhạt. Ngoài ra, cá rô phi bị bệnh có các đốm xuất huyết trên thân, giải phẫu cá rô phi bệnh trên gan có các đốm hoại tử màu trắng đục. Theo Ugajin (1981) Streptococcus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu dạng chuỗi, oxidase và catalase âm tính, không di động, Indole, lysine, Voges – Prokauer điều âm tính (trích bởi Đào Minh Hải, 2006) và đây cũng là kết quả nghiên cứu của Đào Minh Hải (2006) thu được chủng Streptococcus trên cá kèo nuôi ao. Cũng theo Trần Thị Viên (2007) mẫu cá phân lập được loài vi khuẩn
Streptococcus iniae với các dấu hiệu bệnh lý: lồi mắt, gốc mắt xuất huyết và gan trắng từng vùng nhợt nhạt, vây xuất huyết, bơi lội mất phương hướng, vi khuẩn phân lập được là nhóm vi vhuẩn gram dương, hình cầu dạng chuỗi, không di động và lên men O/F, khuẩn lạc có màu trắng, kích cỡ trung bình, oxidase và catalase âm tính. Joyce và ctv (2000) cho rằng Streptococcus iniae là nguyên nhân gây bệnh và chết nhiều loài cá nuôi (trích dẫn bởi Trần Thị Viên, 2007). Từ những kết quả đó phù hợp với kết quả thu được loài vi khuẩn Streptococcus iniae
trên cá kèo nhưng trong qúa trình định danh bằng kít API 20 Strep có một số chỉ tiêu sai khác với kết quả của nhà sản xuất (Phụ lục 4).
Hình 4.9 Cá bị xuất huyết nặng
Hình 4.10 Kết quả test của vi khuẩn Streptococcus iniae
b) Streptococcus agalactiae ( chủng vi khuẩn A2F7)
Cá có các dấu hiệu bệnh lý như mắt lồi, mờ đục và sưng phù, xuất huyết các vây, gan xuất huyết, tách đàn, bỏ ăn và bơi lội lờ đờ trên mặt nước và tấp mé.
Theo Buller (2004) đây là vi khuẩn gram dương, hình cầu, không di động, Oxidase và Catalase âm tính, lên men trên môi trường O/F, không phát triển trên môi trường TSB (+6,5% NaCl), không có khả năng chuyển nitrat thành nitrit, có dạng khuẩn lạc nhỏ, hình tròn màu trắng đục (Phụ lục 2). Qua kết quả kiểm tra bằng kít API 20 strep định danh được đây là loài vi khuẩn Streptococcus agalactiae (Phụ lục 3) (Hình 4.11, 4.12) nhưng trong qúa trình định danh bằng kít API 20 Strep có một số chỉ tiêu sai khác với kết quả của nhà sản xuất (Phụ lục 4).
Kết quả nghiên cứu của Quan Ngô Huy Tân (2010), cá điêu hồng bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae có dấu hiệu bệnh lý: tách đàn, bỏ ăn và bơi lội lờ đờ trên mặt nước, mắt lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang, cá bơi dạng xoắn. Giải phẫu bên trong các cơ quan nội tạng của cá không thấy thận tăng lên về thể tích do phù nề, gan trắng nhạt. Kết quả nghiên cứu của Trần Thị Viên (2007) khi khảo sát một số bệnh trên cá rô phi (Oreochromis sp) và Lê Thị Kim Loan (2010) trên cá điêu hồng (Oreochromis sp) cũng ghi nhận được dấu hiệu bệnh lý như trên khi cá bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae. Theo Robinson và Meyer (1966) khi bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae thì cơ quan nội tạng cá bị ảnh hưởng, gan và lá lách bị phù nề, gan nhợt nhạt, xuất hiện nhiều khu vực hoại tử, lá lách tăng lên về thể tích. Cá hoạt động bất thường, bơi dạng xoắn, mắt bị ảnh hưởng với tần số cao, mờ đục và sưng phù.
Hình 4.11 Cá bị lồi mắt và xuất huyết
Hình 4.12 Kết quả test của vi khuẩn Streptococcus agalactiae
Mẫu cá phân lập được loài vi khuẩn Streptococcus phocae có dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết ở vây hậu môn, vây bụng, gan nhạt màu và cong thân. Khi quan sát tiêu bản tươi mô thận của cá bệnh sẽ thấy vi khuẩn nằm rải rác hoặc tập trung thành từng đám trên vùng mô phết kính bên cạnh các tế bào biến dạng.
Hình 4.13 Cá xuất huyết và gan nhạt màu
Theo Buller (2004) loài vi khuẩn S. phocae có các chỉ tiêu sinh lý: gram dương, hình cầu, không di động, Oxidase và Catalase âm tính, không lên men O/F, có phát triển trên môi trường TSB (+6,5% NaCl), loài vi khuẩn này có hoặc không có khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit (Phụ lục 2). Ngoài ra, dựa trên kết quả kiểm tra bằng kit API 20 strep định danh là loài Streptococcus phocae
(Phụ lục 3), (Hình 4.14) nhưng trong qúa trình định danh bằng kít API 20 Strep có một số chỉ tiêu sai khác với kết quả của nhà sản xuất (Phụ lục 4).
Hình 4.14 Kết quả test của vi khuẩn Streptococcus phocae
d) Lactococcus raffinolactis ( chủng vi khuẩn B1K2F1)
Mẫu cá phân lập được loài vi khuẩn Lactococcus raffinolactis có dấu hiệu bệnh lý là gan bị xuất huyết (Hình 4.15). Lactococcus raffinolactis có dạng khuẩn lạc nhỏ tròn trắng đục, vi khuẩn hình cầu, gram dương, không di động, Oxidase và Catalase âm tính, không có khả năng lên men O/F, vi khuẩn không có khả năng phát triển trong môi trường TSB (+6,5% NaCl) và chuyển hóa nitrat thành nitrit (Phụ lục 2). Kết quả kiểm tra bằng kit API 20 strep (Hình 4.16) cho
kết quả phù hợp với các chỉ tiêu của Buller (2004) nhưng trong qúa trình định danh bằng kít API 20 Strep có một số chỉ tiêu sai khác với kết quả của nhà sản xuất (Phụ lục 4).
Hình 4.15 Gan cá xuất huyết
Hình 4.16 Kết quả test của vi khuẩn Lactococcus raffinolactis
e) Enterrococcus faecium (chủng vi khuẩn B3K1F2)
Theo Buller (2004) loài vi khuẩn Enterrococcus faecium có dạng hình cầu, gram dương, không di động, Oxidase, Catalase và O/F cho kết quả âm tính, vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường TSB (+6,5 NaCl), vi khuẩn không thể biến đổi nitrat thành nitrit (Phụ lục 2). Kết quả bộ kit API 20 strep cũng cho thấy được vi khuẩn phân lập là Enterrococcus faecium (theo Buller, 2004) (Hình 4.17 và Phụ lục 3) nhưng trong quá trình định danh bằng kít API 20 Strep có một số chỉ tiêu sai khác với kết quả của nhà sản xuất (Phụ lục 4). Dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên khắp cơ thể và gan (Hình 4.17).
Ngưng kết miễn dịch
Kết quả định týp bằng kit strep-B-latex để kiểm tra khả năng ngưng kết miễn dịch của 10 chủng đều cho kết quả âm tính (Hình 4.18).
Hình 4.18 Ngưng kết miễn dịch
B A
CHƯƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1 Kết luận
1. Quá trình điều tra 6 hộ nuôi thì các hộ đều sử dụng thuốc Amoxicillin và Enrofloxacin để điều trị bệnh cho cá khi có bệnh xảy ra.
2. Dấu hiệu bệnh lý ghi nhận được: bơi lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động, màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, trên bụng, nắp mang và thường xuất huyết ở vi ngực, vi bụng, vi lưng và vi hậu môn, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và phù ra, xoang bụng chứa đầy dịch nhờn, gan xuất huyết hoặc tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to hoặc teo nhỏ và xuất huyết, thận xuất huyết và bị nhũn, mật sưng to.
3. Thành phần vi khuẩn phân lập được trên mẫu cá bệnh gồm 5 loài:
Streptococcus iniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus phocae, Lactococcus raffinolactis, Enterrococcus faecium.
5.2 Đề xuất
1. Nên khảo sát bệnh xuất huyết ở một số hộ nuôi trong suốt một vụ nuôi để rõ hơn về sự xuất hiện bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ambak et al., 2007 Reproductive biology of the goby Pseudapocryptes lanceolatus in the coastal mud flat areas of the Mekong Deltal. Journal of Sustainability Science and Management, 2(2): 21-30.
2. Bùi Thị Mỹ Duyên, Lê Xuân Sinh và Trương Hoàng Minh, 2010. Phân tích chuỗi giá trị cá kèo (Pseudapocryptes elongatus) ở tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu. Tạp chí khoa học trường ĐHCT 2010, 13: 401-412.
3. Buller, Nick B. 2004. Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual. 361pp
4. Dinh et al., 2007. Biology and population dynamis of the goby Pseudapocryptes elongatus in the coastal mud flat areas of the Mekong Delta, Vietnam. Pakistan Journal of Biologycal Sciences, 10 (19): 3284- 3294.
5. Dinh et al., 2007. Biology and population dynamis of the goby Pseudapocryptes elongatus in the coastal mud flat areas of the Mekong Delta, Vietnam. Pakistan Journal of Biologycal Sciences, 20: 165-179 6. Dương Nhựt Long, 2005. Giáo trình Kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt.
Khoa Thủy Sản – Trường Đại Học Cần Thơ. 194 trang
7. Đào Minh Hải, 2006. Khảo sát một số yếu tố môi trường và mầm bệnh trên cá kèo nuôi ao.
8. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011. Giáo trình nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản. Khoa thủy sản – Trường Đại Học Cần Thơ.
9. Huỳnh Công Minh, 2010. Phân lập và định danh mầm bệnh vi khuần trên cá lóc (Channa Striata) bị bệnh xuất huyết. Luận văn tốt nghiệp đại học.
10. Lê Kim Yến, 2005. Hiện trạng khai thác giống và nuôi cá kèo thương phẩm (Pseudepocrypteselongatus, Cucier 1916) tại Bạc Liêu.
11. Lê Thị Kim loan, 2010. Xác định LD50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae Typ 2 TI 016 trên cá điêu hồng (Oreochromis sp). Luận văn tốt nghiệp đại học.
12. Lư Trí Tài, 2010. Tìm hiểu một số mầm bệnh thường gập trên cá lóc (Channa striata) trong ao nuôi thâm canh. Luận văn tốt nghiệp cao học. 13. Lê Văn Lĩnh, 2009. Ảnh hưởng các độ mặn khác nhau lên sinh trưởng và tỉ
lệ sống của cá kèo (Pseudapocryptes lanceolatus , Bloch 1801). Luận văn tốt nghiệp đại học.
14. Nguyễn Tấn Nhơn, 2008. Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ nuôi lên sinh trưởng, năng suất và hiệu quả kinh tế của cá kèo (Pseudapocryptes lanceolantus) nuôi trên bè và trong ao đất. Luận văn tốt nghiệp đại học. 15. Quan Ngô Huy Tân, 2010. Xác định LD50 của cá điêu hồng (Oreochromis
sp) bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus agalactiae. Luận văn tốt nghiệp đại học.
16. Quách Xuân Bửu, 2009. Xác định một số yếu tố sinh thái và sinh học của cá kèo (Pseudapocryptes elongatus) trong ao nuôi quảng canh cải tiến ở tỉnh Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp đại học.
17. Tiêu Minh Luân, 2002. Nghiên cứu một số đặc điểm của cá kèo (Apocrypteidae) phân bố vùng ven biển tỉnh Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ.
18. Trang tin Xúc tiến Thương Mại – Bộ Nông Nghiệp và PTNT, 2011. Bạc Liêu: Sản lượng thuỷ sản năm 2011 vượt mức kế hoạch 7%. http://xttm.agroviet.gov.vn/XTTM/vi-VN/64/109/56867/Default.aspx. Truy cập:Thứ Sáu, 09/12/2011, 16:10 (GMT+7)
19. Trần Đắc Định, Võ Thành Toàn và Trần Thị Thanh Lý, 2011. Tập tính di cư của cá kèo (Pseudapocryptes elongatus) phân bố ở khu vực ven biển Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học 2011:18a 56-64.
20. Trần Đắc Định, Hà Phước Hùng, Nguyễn Trọng Hồ và Nguyễn Văn Lành, 2002. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của cá kèo Pseudapocrypteselongatus
(Cuvier, 18160 phân bố ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại Học Cần Thơ, 15 trang.
21. Trần Thị Thanh Lý, 2010. Nghiên cứu một số yếu tố liên quan đến tập tính di cư của cá kèo vẩy nhỏ (Pseudepocryptes elongatus, Cucier 1986) ở tỉnh Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp cao học. Đại Học Cần Thơ.