Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu

Một phần của tài liệu ứng dụng kỹ thuật pcr genotyping (orf75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon) (Trang 41 - 44)

Sau khi tiến hành chuẩn hóa một số thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng thì thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng của qui trình PCR genotyping (ORF75) được chọn để ứng dụng trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú như sau:

Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất được sử dụng để ứng dụng

Hóa chất PCR bufer

MgCl2

dNTPs

ORF75- Flank Forward ORF75- Flank Reverse Taq ADN polymerase Nước ADN chiết tách Tổng thể tích Nồng độ 1X 1,5 mM 200 µM 20pmol 20 pmol 2,0U Thể tích 1 mẫu 5 µl 1,5 µl 0,5 µl 1 µl 1 µl 0,4 µl 14,6 µl 1 µl 25 µl

Thành phần hóa chất được sử dụng để ứng dụng chỉ khác với qui trình ban đầu ở lượng ADN chiết tách. Còn các thành phần hóa chất khác và tổng thể tích phản ứng không thay đổi so với qui trình ban đầu.

Điều kiện phản ứng thì thay đổi khác so với qui trình ban đầu. Điều kiện phản ứng được thực hiện với điều kiện là: máy được làm nóng đến 85oC. Sau đó đến giai đoạn 94oC trong 3 phút, 94oC trong 30 giây, 49oC trong 30 giây, 72oC trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và cuối cùng là 72oC trong 7 phút.

Qui trình trên được chạy ứng dụng với 8 mẫu có cường độ nhiễm khác nhau (được kiểm tra là dương tính bằng bộ kit IQ2000-WSSV) nhằm kiểm tra tính ứng dụng của qui trình sau khi tối ưu. Và kết quả như sau:

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

500bp

Hình 4.8: Kết quả ứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau Giếng M Thang ADN 100bp

Giếng 1 Mẫu N4 Giếng 2 Mẫu W1 Giếng 3 Mẫu W4 Giếng 4 Mẫu W5 Giếng 6 Mẫu M8 Giếng 7 Mẫu M10 Giếng 8 Mẫu M11 Giếng 9 Đối chứng âm Giếng 10 Đối chứng dương Giếng 5 Mẫu M9

Từ kết quả trên cho thấy các mẫu có kích thước sản phẩm khác nhau. Qua các mẫu khảo sát (hình 4.8) thì kích thước sản phẩm có 4 dạng, các dạng kích thước sản phẩm được xác định nằm trong các khoảng là: 400-500bp (giếng 1, 2, 3, 4), 600-700bp (giếng 10), 800-900bp (giếng 5), 900-1000bp (giếng 6, 7, 8). Vì vùng lặp lại thuộc ORF75 có 2 loại trình tự lặp lại là 45bp, 102bp cho nên không thể dùng công thức để xác định chính xác số lần lặp lại của các trình tự giống như ORF94 và ORF125. Nên chỉ xác định được các dạng của sản phẩm. Nếu muốn xác định chính xác số lần lặp lại của vùng ORF75 thì phải giải mã trình tự của nó. Do điều kiện không cho phép nên đề tài chỉ thực hiện đến đây.

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Một phần của tài liệu ứng dụng kỹ thuật pcr genotyping (orf75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon) (Trang 41 - 44)

Tải bản đầy đủ (DOCX)

(56 trang)
w