II.1 Nguyên vật liệu và hóa chất
II.1.1 Giống vi sinh vật
Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 alpha.
E.coli được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria – Bertani) [1% tryptone, 0.5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100µg/ml ampicillin để làm nhân tố chọn lọc.
II.1.2 Plasmid:
DNA mang gen Trehalase được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh Học Hàn Quốc, Seoul
II.1.3 Hóa chất
Tinh bột tan (Trung Quốc), bactotryton (Hàn Huốc), bacto yeast extract (Hàn Quốc), NaCl (Trung Quốc), canxiclorua (Trung Quốc), agar (Việt Nam), glycerol (Việt Nam), acrylamide (Trung Quốc), N,N-methylene-bis Acrylamide (Trung Quốc), glycine (Trung Quốc), sodiummetabisulfate (Trung Quốc), methanol (Trung Quốc), acetic acid (Trung Quốc), Amononium persulfate (ASP, USA), Ampicillin (USA), comassie-blue R-250 (USA), axit photphoric (Trung Quốc), ethanol (Trung Quốc), Tris-base (Sigma, USA), phenol (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), potassium Sodium Tartrate (Trung Quốc), EDTA (USA), SDS (USA), DNS 3,5 Dinitro salicylic (Trung Quốc), Imidazole (Hàn Quốc), Glucose (Trung Quốc), Maltose (Trung Quốc), NaH2PO4(Trung Quốc), Na2HPO4(Trung Quốc), 2- mercaptoethanol (Đức), Bromophenol blue (Đức), NaHCO3 (Trung Quốc), Na2CO3(Trung Quốc), potassium acetate (Hàn Quốc), Boric axit (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), TEMED (Trung Quốc), APS (Trung Quốc), Dithiotheritol (Hàn Quốc), Ethidumbromide (Hàn Quốc)
II.1.4 Máy móc và thiết bị
Máy li tâm (Trung Quốc), máy so màu quang điện, máy đo pH, máy lắc (Trung Quốc), bình ổn nhiệt (Trung Quốc), nồi hấp (Trung Quốc), máy khuấy từ (Trung Quốc), máy siêu âm (Trung Quốc), cân điện tử (Đức), máy điện di (Trung Quốc), tủ sấy, box cấy (Trung Quốc), cân kỹ thuật (Mỹ), buồng điện di DNA (Nhật), máy li tâm lạnh siêu tốc liên tục (Đức).
Và các dụng cụ cần thiết khác như bình tam giác, ống nghiệm, ống eppendof, đầu côn xanh, đầu côn vàng, đĩa peptri, pipet thủy tinh và pipet ...
II.2 Phương pháp nghiên cứu
II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha bằng phương pháp sốc nhiệt
Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang thể nhận.
Có nhiều phương pháp biến nạp được sử dụng như biến nạp bằng xung điện, sốc nhiệt…Trong đó biến nạp bằng sốc nhiệt là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao. Cơ chế biến nạp chủ yếu bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể tiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp nhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả biến
Nguyên tắc: Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA. Tạo hỗn hợp vi khuẩn với DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao (4oC). Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và cố định trong tế bào vi khuẩn. Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứa môi trường có bổ sung kháng sinh.
Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
Phương pháp tiến hành như sau: + Tạo tế bào khả biến DH5 alpha
Hoạt hóa tế bào E.coli trên môi trường thạch LB (1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl; 2% Agar) ở 37oC, 24 giờ. Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 5ml LB lỏng
Hình 6: Vi khuẩn E.coli trong LB rắn (khuẩn lạc)
Môi trường LB lỏng: 1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl
Nuôi trên máy lắc (37oC, 12 – 14 giờ). Sau đó lấy 1% dịch nuôi cấy trên (50µl cho 50ml môi trường nuôi cấy LB) tiến hành lắc trên máy lắc 200 – 250 rpm ở 37oC để đạt được Abs 600 (khoảng 2 – 3 giờ). Tiếp đó chuyển dịch nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000 rpm trong 5 phút.
Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12.5 ml) dung dịch 50mM CaCl2. Lắc nhẹ để làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phút trên đá. Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên và cho vào 1/10 thể tích (2.5 ml) dung dịch 100mM CaCl2 và làm tan hoàn toàn cặn. Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerol bảo quản trong nitơ lỏng.
+ Biến nạp
Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µl DNA. Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt 2 phút ở 42oC. Sau sốc nhiệt bổ sung thêm 1ml LB và ủ ở 37oC trong 1h. Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biến nạp trên cấy trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (100ml LB, 100µl Amp) và để phát triển qua đêm ở 37oC.
Hình 7: Vi khuẩn E.coli sau khi biến nạp trong LB rắn có kháng sinh Tất cả các thao tác đều làm trong box cấy vô trùng, các dụng cụ đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
II.2.2 Tách DNA plasmid
DNA tái tổ hợp sau khi được biến nạp vào chủng DH5 alpha sẽ nhân lên thành nhiều bản sao cùng với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Sau đó vector tái tổ hợp được tách chiết ra khỏi DNA genom vi khuẩn bằng cách xử lý với NaOH, SDS. Trong điều kiện này, DNA genom của vi khuẩn ở dạng mạch thẳng có phân tử lượng lớn sẽ bị đứt gãy còn plasmid ở dạng mạch vòng có kích thước phân tử nhỏ và bền vững nên sẽ không bị đứt gãy. Protein và tạp chất được loại bỏ bằng hỗn hợp Chloroform: iso – amyl alcohol. DNA
plasmid thu được nhờ quá trình kết tủa với cồn và muối CH3COONa. Có rất nhiều phương pháp tách plasmid như: tách plasmid bằng phương pháp kiềm, tách plasmid bằng phương pháp boiling.
Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng, nhặt một khuẩn lạc E.coli chứa plasmid từ đĩa petri nuôi cấy tế bào qua đêm vào ống nghiệm hoặc bình tam giác có chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh Ampicillin (nồng độ 100µg/ml) nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC, tốc độ 200 vòng/phút. Thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong các eppendoff 1.5ml. Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối loại dịch nổi. Đồng nhất tế bào, cho 100µl Sol I vào trong ống eppendoff chứa tế bào, hòa tan tế bào bằng máy vortex.
Dung dịch Sol I: 25mM Tris – HCl pH 8.0; 10mM EDTA pH 8.0; 50mM glucose. Dung dịch được khử trùng ở 126oC và được cất giữ ở 4oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phá màng tế bào, cho 200µl Sol II vào tiếp, dùng tay đảo ngược ống eppendoff nhanh, nhẹ nhàng từ 3 – 5 lần.
Dung dịch Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS
Cho 150µl Sol III vào tủa protein, dùng tay đảo nhẹ ống từ 3 – 5 lần. Dung dịch Sol III: 3M Potasium Acetate pH 5.5; acetic acid 11.5M dung dịch được khử trùng và cất giữ ở 4oC
Sau đó ly tâm ở 4oC với tốc độ 10000 rpm/phút trong 20 phút. Dùng pipet lấy dịch trong ở trên cho vào eppendoff mới (eppendoff được khử trùng) bỏ cặn. Lấy 600 - 800µl Isopropanol cho vào và lắc lên lắc xuống nhiều lần. Đem ly tâm ở 4oC với tốc độ 12000rpm/phút trong 10phút. Ta bỏ dịch phía trên đi, lấy cặn (DNA). Ta cho 500µl cồn 70% (cồn để lạnh) để rửa DNA, dùng pipet bơm lên, bơm xuống cho DNA tung ra. Ly tâm lạnh ở 12000 rpm/phút trong 15 phút sau đó lấy hết cồn ra rồi thực hiện rửa cồn 1 lần nữa. Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng.
Hòa tan DNA plasmid tách được trong 40µl dung dịch TE hoặc nước cất vô trùng. Điện di mẫu kiểm tra mấu DNA plasmid trên gel agarose 0.8%. Bảo quản mẫu ở -20oC.
II.2.3 Xác định DNA biểu hiện ở E.coli trên gel Agarose
Nguyên tắc: Phương pháp điện di DNA trên gel agarose dựa vào đặc tính tích điện âm của phân tử axit Nucleic ở pH trung tính nhờ các nhóm photphat nằm trên các cầu nối phosphodiester của axit Nucleic. Khi được đặt trong điện trường, các phân tử axit Nucleic sẽ dịch chuyển về cực dương với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử có kích thước bé. Khả năng di động của các phân tử axit Nucleic này còn phụ thuộc vào nồng độ gel. Ở đây chúng tôi sử dụng gel agarose 0.8%. Các axit Nucleic trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ hóa chất ethidium bromide.
Phương pháp tiến hành: 0.8% agarose gel trong dung dịch đệm TBE được đổ trên một giá thể nằm ngang (chuẩn bị gel agarose vào dung dịch đệm đun cho agarose tan hoàn toàn). Để nguội khoảng 50oC,cho 1µl ethidium bromide vào rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ dung dịch chạy điện di là đệm TBE (40mM Tris HCl và 2 mM EDTA, pH 8.) vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel khoảng 2mm và tiến hành tra mẫu. Trộn mẫu với 1.5µl đệm màu xanh 1X – xanh Bromophenol. Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 100V, thời gian là 25 – 30 phút. Sau khi chạy xong lấy bản gel ra và đem soi bằng tia tử ngoại UV 280 nm, plasmid DNA là những vạch màu da cam được so sánh với marker DNA ta xác định được kích thước và độ tinh sạch của DNA.
II.2.4 Phương pháp phá vỡ tế bào
Protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn là một bước quan trọng đặc biệt đối với nghiên cứu trong các lĩnh vực hóa sinh học, vi sinh học và sinh học phân tử cũng như cho sự phát triển của quá trình sản xuất protein trong công nghệ sinh học và kỹ thuật sinh hóa. Hiện nay, protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn thường được sử dụng phương pháp cơ học, đòi hỏi dụng cụ tương đối đắt tiền và đòi hỏi kỹ năng kỹ thuật.
Đệm lysis i4 đã được phát triển bằng công nghệ Enzyme phòng thí nghiệm của các quốc gia Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học (BIOTEC-Thailand) để cung cấp một giải pháp rẻ tiền để chiết xuất protein, DNA. Có rất nhiều phương pháp để phá vỡ tế bào: phương pháp phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học và phi cơ học. Trong đó, phương pháp cơ học gồm có rất nhiều phương pháp như phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm, phá vỡ tế bào bằng máy đồng hóa cao áp, phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông,… Phương pháp không bằng cơ học như phương pháp sốc thẩm thấu, phương pháp xử lý kiềm,…
Do enzyme của chúng tôi là enzyme nội bào nên ở đây chúng tôi sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào. Các bộ đệm lysis đã được xây dựng để thu protein vi khuẩn bằng cách sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào. Điều quan trọng ở đây là chúng tôi sử dụng dung dịch phá vỡ tế bào rất có hiệu quả với nhiều loại tế bào vi khuẩn, nấm trong khi vẫn bảo toàn hàm lượng và hoạt tính của protein. Dung dịch đệm cũng được sử dụng cho tách chiết DNA từ vi sinh vật.
Các đặc điểm của đệm lysis i4:
- Dung dịch đệm có thể được sử dụng tách protein một cách hiệu quả từ rất nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, nấm men, nấm.
- Quá trình đơn giản và dễ làm
- Đồ dùng và dụng cụ, máy móc không đòi hỏi cao
- Dung dịch đệm không làm phản ứng biến tính và cung cấp protein để sử dụng cho thí nghiệm hóa học hay sản xuất protein trong công nghệ sinh học
- Ngoài ra dung dịch đệm này còn được sử dụng ở bước bổ sung cho việc tách DNA một cách hiệu quả
Phương pháp tiến hành:
Lấy 2 ống eppendoff sạch đem cân ống eppendoff trên cân phân tích và ghi lại trọng lượng.
(đã biến nạp, đĩa petri LB thạch có kháng sinh). Nuôi cấy tế bào qua đêm vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc qua đêm ở 37oC tốc độ 200v/p
Sau đó thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong 2 eppendoff mà ta vừa cân được đem ly tâm ở 6000rpm/phút trong 20 phút ở 4oC để thu sinh khối. Bỏ dịch trong và cân trọng lượng tế bào thu được.
Bổ sung 200-300 µl/100mg tế bào. Sau đó, hòa tan cặn bằng vortex và đem ngâm đá 15 – 20 phút. Ly tâm 10 000 v/phút trong 30 phút rồi bỏ cặn thu dịch nổi.
II.2.5 Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford
Cơ sở của phương pháp: hàm lượng protein – enzyme đã được xác đi ̣nh vào năm 1976 bằng phương pháp của bradford. Cơ sở của phương pháp là dựa vào đô ̣ hấp thu ̣ màu của phản ứng giữa enzyme và dung di ̣ch Bradford, dựa vào đồ thi ̣ chuẩn BSA-Bradford để tính hàm lượng protein – enzyme.
Phương pháp tiến hành: cho 100µl dung di ̣ch protein pha loãng vào 900µl dung di ̣ch Bradford (100mg Coomassie Brillitant Blue G250 hòa tan 500 ethanol, bổ sung 100ml phosphorich acid 85%, sau đó đi ̣nh mức đến 1lít bằng nước cất). Chuẩn bi ̣ blank (mẫu đối chứng) bằng cách bổ xung nước cất thay cho protein. Hỗn hơ ̣p phản ứng giữ ở nhiê ̣t đô ̣ phòng trong 5 phút, cứ 1 phút vortex mô ̣t lần. Sau đó, hỗn hợp được đo quang phổ ở bước sóng 595nm bằng máy spectrophotometer (máy so màu). Đô ̣ hấp thu ̣ quang của dung dịch phản ứng dựa vào đồ thi ̣ đường chuẩn BSA-Bradford tính được nồng đô ̣ enzyme – protein có trong mẫu.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford có: Y = 1.0361x + 0.0524
R2 = 0.9944
Phương pháp tính toán hàm lượng protein – enzyme được viết như sau: X (mg/ml) = (∆abs - 0.0524): 1.0361 *D*RF
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});