2.1Ứng dụng trong phân tích chất
Một ứng dụng khác của E cố định trong lĩnh vực y học là thực hiện định lượng đường máu (Glucose) hiệu quả hơn. Nồng độ glucose bình thường trong máu người khoẻ mạnh, lúc đói là: 4,4 – 6,1 mmol/l (0.8-1.1g/l). Trước kia, định lượng đường máu theo phương pháp Folin - Wu là phương pháp định lượng không đặc hiệu dựa vào tính khử của đường cho nên khi trong máu bệnh nhân có các chất khử khác (ví dụ vitamin C) nó sẽ tạo nên kết quả cao hơn nồng độ đường thực có.
Hiện nay, định lượng đường máu đặc hiệu là phương pháp enzym - màu. Đó là phương pháp định lượng đường máu dựa trên phản ứng xúc tác của gluco- oxidase: oxy hóa glucose thành acid gluconic và peroxidhydrogen (H2O2). H2O2
tác dụng với 4 - aminoantipyrine và phenol dưới xúc tác của peroxidase (POD) tạo thành chất có màu hồng là quinoneimine và nước. Đo mật độ quang của đỏ quinoneimine ở bước sóng 500nm sẽ tính được kết quả đường máu.
CHO-(CHOH)4 - CH2OH + O2 , E gluco oxydase COOH –( CHOH )4–CH2OH Gluco oxydase được gắn lên điện cực platin, khi đo nhúng điện cực vào dung dịch rồi đo kết quả phản ứng. Bằng phường pháp enzym, kết quả đường máu chính xác hơn, không phụ thuộc vào các chất khử.
b. E cố định sử dụng trong biosensor (cảm biến sinh học)
Hình 8: Hệ thống biosensor [7]
Các E cố định được sử dụng trong biosensor để chẩn đoán và mục đích khác. Một biosensor được cấu tạo từ 1 thụ thể sinh học và 1 hệ thống chuyển tiếp. thụ thể sinh học (bioreceptor) là phân tử sinh học nhận biết được nhân tố đích, sự nhận biết đó được nhân tố chuyển tiếp biến thành tín hiệu có thể đo được. Tính độc đáo của biosensor là hai thành phần trên được kết hợp thành một đầu dò duy nhất. Sự kết hợp này giúp đo được nhân tố đích cần phân tích mà không cần các chất phản ứng. Điều này thuận lợi so với việc xét nghiệm qua nhiều bước và mỗi bước phải sử dụng một chất phản ứng đối với mẫu. Ezyme là biosenssor nhờ khả năng nhận biết đặc hiệu, các bioreceptor gồm kháng thể, nucleic acid và các protein thụ thể. Sự nhận biết này thông qua tương tác yếu giữa nhóm trên bề mặt trình diện E và ở các phân tử khác không phải E.
Cách đo đơn giản và nhanh là thuận lợi chính của biosensor sử dụng E cố định, và có thể cho ra kết quả định tính và định lượng.
GDH của B.cereus được sử dụng vàp mục đích này vì nó có tính đặc hiệu cao, chỉ oxy hóa D – gluco. Phản ứng xảy ra như sau :
Lượng NADH tạo thành được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, từ đó định lượng gluco trong máu.
Như việc nghiên cứu sử dụng E acetylcholin esterase được cố định để ứng dụng tạo biosensor nhạy cảm, có khả năng phát hiện ra thuốc trừ sâu OP (organophosphate), parauxon. Trong khoảng 0.4 – 2 ppm với thời gian phân tích là 15 phút cũng đã có những kết quả khả quan. [8]
2.2 E cố định trong công nghiệp kháng sinh a. Penicillin a. Penicillin
Penicillin G [9]
6- APA [10]
E penicillin amydase cố định đóng vai trò thiết yếu trong quá trình sản xuất penicillin bán tổng hợp. Penicillin là một nhóm chất có tính kháng sinh, có cấu tạo chung gốc R là gốc acyl thì ta có penicillin G và là loại phổ biến nhất hiện nay. E penicillin amydase xúc tác thủy phân penicillin G để tạo thành nhóm 6 – aminopenicillanic (6 – APA và acid phenyl acetid. Bằng cách loại bỏ chuỗi bên của penicillin G tự nhiên thu được lượng lớn trong quá trình lên men, sau đó gắn nhánh mới vào lõi 6 – aminopenicillanic acid. Vậy dung dịch penicillin G đi qua bioreactor chứa penicillin acylase cố định và sản phẩm đầu ra là 6 – aminopenicillanic acid kết tủa ở pH 4,2 – 4,3 và được thu nhận.
Năm 2000, E.Katchalski – Katzir và D.M.Kraemer đã dùng chất mang là Eupegit C, là một polymer dạng hạt, có các nhóm chức epoxide hoạt động để gắn
penicillin G amydase bằng liên kết cộng hóa trị. Chế phẩm E không tan này có thể dùng lặp lại 600 lần, phản ứng được thực hiện trên quy mô công nghiệp ở nhiệt độ 30 – 40oC và pH 7.5 – 8.0. Tỷ lệ chuyển hóa trong điều kiện này rất tốt, đạt 98%.
E nội bào được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn E.coli, B.facecalic. Với môi trường casein thủy phân, cao ngô, glucose... làm chất cảm ứng. Chất mang ở đây có thể là gel polyacrylamid, sephadex, dextran… 6 – APA được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm để sản xuất các loại kháng sinh họ penicillin. Hiện nay toàn bộ 6 – APA của thế giới đều được sản xuất bằng phương pháp sử dụng E penicillin amydase cố định.
b. Bacitracin
Bacitracin là một hỗn hợp polypetide, có ở tế bào Bacillus.spp. Trong sản xuất công nghiệp, ezyme được cố định trong màng gel polyacrylamide để sản xuất kháng sinh bacitracin. Ngoài ra bacitracin có thể kết hợp với các loại kháng sinh khác, sử dụng như thuốc mỡ dùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng da mắt, phòng chống các bệnh nhiễm trùng vết thương.
c. Tylosin và nikkomycin
Tylosin [11]
Tylosin và nikkomycin có thể được sản xuất bởi tế bào sống của
Streptomycin spp, được cố định bằng canxium algenat. Tylosin được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra do vi khuẩn kháng thuốc, bệnh viêm kết tràng ở động vật… Ngoài ra còn được sử dụng như chất hoạt hóa tăng trưởng. Nikkomycin là kháng sinh có khả năng ức chế sinh tổng hợp chitin ở vách tế bào bằng cách ức chế cạnh tranh chitin symthase, tác dụng quan trọng trong các điều trị nhiễm trùng. [12]
c. Sản xuất prednisolone điều trị thấp khớp
Sử dụng 2 E không tan là steroid 11β – monooxygenase và - dehydrogenase. Hai E này xúc tác cho quá trình chuyển hóa 11- deoxycortisol, một tiền chất tương đối rẻ, thành prednisolone, có tác dụng điều trị cao.
Trong thận nhân tạo có các E không tan như urease, glutamate dehydrogenase, alcoholdehydrogenase. Quá trình được thực hiện như sau: urea trong máu của bệnh nhân được đưa vào thận nhân tạo nhờ thẩm tích, urease phân giải urea thành CO2 và NH4+, loại NH4+ bằng nhựa trao đổi ion hay glutamate dehydrogenase phối hợp với alcoholdehydrogenase để quay vòng CoE trước khi dịch được đưa trở lại vào máu. Từ đó để urea và các chất thải khác khỏi cơ thể của người bị bệnh thận.
Ngoài ra trong y học E cố định còn dùng để làm các nội quan giả như bàng quan, niêm mạc... Sử dụng E ở dạng vi tiêm (micro capsul) để đưa E vào chữa trị bệnh thiếu E nhưng không gây nên các phản ứng phụ. Nghiên cứu cấu trúc phân tử E, cấu tạo màng tế bào, mô hình hóa hệ thống enzyme trong tế bào.
Một số ứng dụng khác như vi tiểu cầu chứa catalase đã có thể thay thế một cách có hiệu qủa số catalase bị thiếu sốt trong cơ, đưa vi tiểu cầu có gắn E L - asparaginase vào cơ thể có khả năng ức chế sự phát triển của một số u ác tính vì sự phát triển các u này phụ thuộc vào sự có mặt của L - asparagin.