V. Phương pháp.
1. Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm môi trường nuôi cấy các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập được.
nuôi cấy các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập được.
Sau khi chuyển 10µl dịch trích vào ống nghiệm có chứa môi trường NFb bán đặc, được ủ trong tủ ở 300C từ hai đến ba ngày (tùy từng dòng), các dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ (lúa hoang, lúa trồng) và thân lúa hoang đều sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Sự phát triển này tạo thành một vòng pellicle trắng đục bên dưới môi trường ống NFb bán đặc khoảng 2,0 - 5,0mm (hình 3), lớp màng này đặc trưng cho sự phát triển của vi khuẩn. Những đặc điểm này phù hợp với mô tả trong những nghiên cứu trước đây của Rodriguez và ctv (1982), Hiệp và ctv (2005), Nguyễn Khắc Minh Loan (2005), Đào Thanh Hoàng (2005).
Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt môi trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi trường
Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum trong môi trường NFb bán đặc với chất chỉ thị màu là bromothymol blue (pH = 6,8), làm môi trường màu xanh lá dần chuyển sang màu xanh dương sau 2 - 3 ngày nuôi cấy. Độ nhạt hay đậm tùy thuộc vào sự phát triển của từng dòng. Sau 3 ngày nuôi cấy thì môi trường sẽ đổi hoàn toàn sang xanh dương.
Vòngpellicle
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp
Trang 22
Trong môi trường NFb đặc để phân lập, sự phát triển của vi khuẩn
Azospirillum cũng làm thay đổi pH của môi trường (pH ban đầu trung tính, sau đó trở nên kiềm hơn), màu môi trường cũng chuyển từ xanh nhạt sang xanh dương và tùy thuộc vào từng dòng sau 2 đến 3 ngày (hình 4). Kết quả, chúng tôi thu được 44 dòng vi khuẩn Azospirillum, ký hiệu AT (Azospirillum được phân lập từ thân lúa hoang) và AR (Azospirillumđược phân lập từ rễ lúa hoang và lúa trồng) (bảng 1). Các dòng vi khuẩn này được trữ trong môi trường ống NFb đặc có bổ sung thêm dịch trích nấm men (yeast extract) (5g/l) và KNO3 (50ml/l), sau đó được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C.
Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb đặc làm thay đổi màu môi trường
Các dòng vi khuẩn Azospirillum mà chúng tôi phân lập được có nguồn gốc từ lúa hoang và các giống lúa trồng tại Cần Thơ (quận Ninh Kiều, Ô Môn, Cái Răng) và một số tỉnh lân cận của vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long như: Vĩnh Long (huyện Bình Minh, Trà Ôn), Hậu Giang (huyện Châu Thành), Trà Vinh (Cầu Kè) (bảng 1).
Kết quả cho thấy đa số các dòng vi khuẩn tăng trưởng mạnh khoảng từ 1 - 2 ngày sau khi cấy (38 dòng ), 6 dòng còn lại có thời gian tăng trưởng chậm hơn (2 - 3 ngày).
Trong số 44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập có 13 dòng từ lúa hoang, chiếm 29,55%, chủ yếu được thu mẫu tại quận Ninh Kiều - Thành Phố
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp
Trang 23
Cần Thơ. Có 20 dòng vi khuẩn từ lúa cao sản (giống lúa IR 505 - 04, Miền Tây Lúa), chiếm 45,45% và 11 dòng vi khuẩn từ lúa mùa (lúa Châu Hạng Võ, Hàm Châu và Cửu Long 8), chiếm 25% trong tổng số 44 dòng vi khuẩn Azospirillum
mà chúng tôi phân lập được.
Đa số các dòng vi khuẩn Azospirillumđược phân lập từ rễ của cây lúa chiếm 86,36% (38 dòng), còn lại 13,64% (6 dòng) được phân lập từ thân lúa hoang.
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang.
STT Dòng Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Thời gian tăng trưởng (ngày)
Cây chủ Nơi lấy mẫu
1 AT1 Thân 1-2 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 2 AT2 Thân 2-3 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 3 AT3 Thân 1-2 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 4 AR4 Rễ 1-2 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 5 AR5 Rễ 2-3 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 6 AT6 Thân 1-2 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 7 AR7 Rễ 1-2 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 8 AR8 Rễ 1-2 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 9 AR9 Rễ 1-2 LH Đại Học Cần Thơ 10 AR10 Rễ 1-2 LH Đại Học Cần Thơ 11 AR11 Rễ 1-2 LH Đại Học Cần Thơ 12 AR12 Rễ 1-2 LH Đại Học Cần Thơ 13 AR13 Rễ 2-3 CHV Châu Thành, Hậu Giang 14 AR14 Rễ 1-2 CHV Châu Thành, Hậu Giang 15 AR15 Rễ 2-3 CHV Châu Thành, Hậu Giang 16 AR16 Rễ 1-2 HC Châu Thành, Hậu Giang
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp
Trang 24
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt)
STT Dòng Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Thời gian tăng trưởng (ngày)
Cây chủ Nơi lấy mẫu
17 AR17 Rễ 1-2 HC Châu Thành, Hậu Giang 18 AR18 Rễ 1-2 HC Cái Răng, TP Cần Thơ 19 AR19 Rễ 1-2 CL8 Cầu Kè, Trà Vinh 20 AR20 Rễ 1-2 IR Bình Minh, Vĩnh Long 21 AR21 Rễ 1-2 IR Bình Minh, Vĩnh Long 22 AR22 Rễ 1-2 CL8 Cầu Kè, Trà Vinh 23 AR23 Rễ 1-2 CL8 Cầu Kè, Trà Vinh 24 AR24 Rễ 1-2 CL8 Trà Ôn, Vĩnh Long 25 AR25 Rễ 1-2 CL8 Trà Ôn, Vĩnh Long 26 AT26 Thân 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 27 AR27 Rễ 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 28 AR28 Rễ 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 28 AT29 Thân 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 30 AR30 Rễ 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 31 AR31 Rễ 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 32 AR32 Rễ 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 33 AR33 Rễ 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 34 AR34 Rễ 1-2 MTL Ô Môn,TP Cần Thơ 35 AR35 Rễ 1-2 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ 36 AR36 Rễ 1-2 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ 37 AR37 Rễ 1-2 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ 38 AR38 Rễ 1-2 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ 39 AR39 Rễ 1-2 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp
Trang 25
Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang (tt)
STT Dòng Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Thời gian tăng trưởng (ngày)
Cây chủ Nơi lấy mẫu
40 AR40 Rễ 1-2 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ 41 AR41 Rễ 1-2 LH Ninh Kiều, TP Cần Thơ 42 AR42 Rễ 2-3 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ 43 AR43 Rễ 2-3 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ 44 AR44 Rễ 1-2 IR Ninh Kiều, TP Cần Thơ *Ghi chú: TP Cần Thơ: Thành phố Cần Thơ IR: giống lúa IR 504-04 MTL: giống Miền Tây Lúa HC: giống lúa Hàm Châu CHV: giống lúa Châu Hạng Võ LH: giống lúa hoang CL8 : giống lúa Cửu Long 8