Phổ hấp thụ hồng ngoại là phương phỏp vật lý hiện ủại cho nhiều thụng tin quan trọng về thành phần và cấu tạo của phức chất.
Cơ sở của phương phỏp phổ hấp thụ hồng ngoại là: chiếu mẫu nghiờn cứu bằng bức xạ hồng ngoại cú thể làm dịch chuyển mức năng lượng dao
ủộng quay của cỏc phõn tử. Mỗi nhúm nguyờn tử trong phõn tử ủược ủặc trưng bằng một số dải hấp thụ nhất ủịnh trong phổ hồng ngoại. Do ảnh hưởng của cỏc nhúm khỏc nhau trong phõn tử, cỏc dải hấp thụ thuộc nhúm ủang xột sẽ bị dịch chuyển về vị trớ hay thay ủổi về cường ủộ. Dựa trờn chiều hướng dịch chuyển, mức ủộ thay ủổi vị trớ cỏc dải hấp thụ cú thể thu ủược những thụng tin quan trọng về cấu tạo của cỏc hợp chất.
Khi phối tử tham gia vào cầu phối trớ của phức chất thỡ phổ hấp thụ hồng ngoại của chỳng bị thay ủổi, sự thay ủổi này cú liờn quan ủến sự thay ủổi kiểu liờn kết giữa ion kim loại và phối tử. để phỏt hiện kiểu thay ủổi ủú, người ta so sỏnh phổ hấp thụ hồng ngoại của những hợp chất chứa phối tử mà cỏc dạng liờn kết trong những hợp chất này ủó ủược xỏc ủịnh rừ. Việc nghiờn cứu phức chất bằng phương phỏp này cũn cho biết kiểu liờn kết trong phức chất.
Việc quy kết cỏc dải hấp thụ ủược thực hiện trờn cơ sở tớnh toỏn cỏc dao ủộng chuẩn (ủối xứng hoặc bất ủối xứng) của cỏc nhúm nguyờn tử. để nhận biết cỏc nhúm nguyờn tử hoặc cỏc nhúm ủặc trưng trong phõn tử hợp chất nghiờn cứu, tra bảng cỏc tần số ủặc trưng trong tài liệu tra cứu.
Việc phõn tớch phổ hồng ngoại của cỏc phức aminoaxit với kim loại khụng phải dễ dàng. Bởi sự hấp thụ của nhúm amin bị xen phủ bởi sự hấp thụ của nhúm nước kết tinh, cũn tần số dao ủộng của nhúm - COO- thỡ khụng những chịu ảnh hưởng của sự tạo phức mà cũn chịu ảnh hưởng của liờn kết hiủro giữa nhúm -C=O với nhúm -NH2 của phõn tử khỏc. Mặt khỏc tần số dao ủộng bất ủối xứng của nhúm - COO- và tần số dao ủộng biến dạng của nhúm NH2 trong phức của amino axit cựng nằm trong vựng gần 1600 cm-1 càng làm khú khăn cho việc qui gỏn cỏc tần số hấp thụ. Do ủú việc gỏn cỏc dải hấp thụ cho cỏc dao ủộng xỏc ủịnh nhiều khi khụng thống nhất. [10]
1.5.3. Phương phỏp ủo ủộ dẫn ủiện
đõy cũng là phương phỏp thuận tiện, ủược ỏp dụng rộng rói ủể nghiờn cứu phức chất. Nguyờn tắc của phương phỏp là: xỏc lập một số trị số trung
bỡnh mà ủộ dẫn ủiện mol (à) hoặc ủộ dẫn ủiện ủương lượng (λ) của dung dịch phức chất dao ủộng xung quanh chỳng. Cỏc giỏ trị này sẽ ủặc trưng cho tớnh chất ủiện li của cỏc phõn tử phức chất trong dung dịch.
Khi nghiờn cứu phức chất bằng phương phỏp này, trước tiờn ta xỏc ủịnh ủộ dẫn ủiện riờng χ của dung dịch cần nghiờn cứu ở một nhiệt ủộ nhất ủịnh, từ ủú ta tớnh ủược ủộ dẫn ủiện mol phõn tử à hoặc ủộ dẫn ủiện ủương lượng λ.
đo ủộ dẫn ủiện mol (à) là ủộ dẫn ủiện của dung dịch chứa một mol hợp chất phức chất, ủặt giữa hai ủiện cực song song cỏch nhau 1 cm. Cũn gọi là ủộ dẫn ủiện mol phõn tử và ủược tớnh theo cụng thức:
à = .1000
M
C
χ ( Ω-1.cm2.mol-1 )
độ dẫn ủiện ủương lượng λ (Ω-1.cm2. ủlg-1) tớnh theo cụng thức: λ = .1000
N
C
χ (Ω-1.cm2. ủlg-1)
Trong ủú χ : ủộ dẫn ủiện riờng của dung dịch (Ω-1.cm-1) CM : nồng ủộ mol/l của dung dịch (M)
CN: nồng ủộ ủương lượng của dung dịch (N)
Nhờ phộp ủo ủộ dẫn ủiện dung dịch cú thể tỡm ủược số lượng ion mà phức chất phõn li ra, từ ủú giới hạn số lượng cụng thức giả ủịnh khi nghiờn cứu cấu trỳc của một phức chất mới.
Khi ỏp dụng cỏc ủịnh luật ủặc trưng của chất ủiện li mạnh thụng thường cho phức chất cú sự tương ứng gần ủỳng là cựng nồng ủộ dung dịch 10-3mol/l ở 250C những phức chất phõn li thành hai ion trong dung dịch sẽ cú ủộ dẫn ủiện mol gần 100 (Ω-1.cm2.mol-1), những phức chất phõn li thành 3, 4 và 5 ion sẽ cú ủộ dẫn ủiện mol khoảng 250, 400 và 500 ( Ω-1.cm2.mol-1). đối với phức chất cú bản chất trung hoà ủiện thỡ ủộ dẫn ủiện rất bộ.
độ dẫn ủiện của dung dịch phức chất phụ thuộc vào cỏc yếu tố sau:
Ớ Bản chất của phối tử
Ớ Cấu tạo của ion phức
Ớ Dung lượng phối trớ của cỏc phối tử
Cỏc phức chất mà phõn tử của chỳng cú cỏc vũng 5 hoặc 6 cạnh ủều rất bền. Vỡ vậy ủộ dẫn ủiện của dung dịch của chỳng thực tế khụng thay ủổi theo thời gian và nhỏ hơn ủộ dẫn ủiện của dung dịch phức chất khụng vũng.
Dựa theo kết quả ủo ủộ dẫn ủiện ở một chừng mực nào ủấy cú thể suy ủoỏn về ủộ bền tương ủối của cỏc phức chất cú cựng kiểu cấu tạo với nhau. đối với cỏc phức chất cú cựng kiểu cấu tạo thỡ dung dịch của phức chất nào cú ủộ dẫn ủiện lớn hơn sẽ kộm bền hơn. [16]
1.6. Thăm dũ hoạt tớnh sinh học của cỏc phức chất
1.6.1 Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm ủịnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm ủịnh ủược thực hiện dựa trờn phương phỏp pha loóng nồng ủộ. đõy là phương phỏp thử hoạt tớnh vi sinh vật kiểm ủịnh và nấm nhằm ủỏnh giỏ mức ủộ khỏng khuẩn mạnh yếu của cỏc mẫu thử thụng qua cỏc giỏ trị thể hiện hoạt tớnh là MIC (Minimum inhibitor concentration Ờ nồng ủộ ức chế tối thiểu), IC50 (50%inhibitor concentration
Ờ nồng ủộ ức chế 50%), MBC (Minimumbactericidalconcentration- nồng ủộ diệt khuẩn tối thiểu). [35]
1.6.1.1. Cỏc chủng vi sinh vật kiểm ủịnh
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm ủịnh gõy bệnh ở người:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường khụng gõy bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gõy mủ cỏc vết thương, vết bỏng, gõy viờm họng, nhiễm trựng cú mủ trờn da và cỏc cơ quan nội tạng.
- Escherichia coli : gram (-), gõy một số bệnh về ủường tiờu hoỏ như viờm dạ dày, viờm ủại tràng, viờm ruột, viờm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gõy nhiễm trựng huyết, cỏc nhiễm trựng ở da và niờm mạc, gõy viờm ủường tiết niệu, viờm màng nóo, màng trong tim, viờm ruột.
- Candida albicans: là nấm men, thường gõy bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và cỏc bệnh phụ khoa.
- Lactobacillus fermentum: gram (+), là loại vi khuẩn ủường ruột lờn men cú ớch, thường cú mặt trong hệ tiờu hoỏ của người và ủộng vật.
- Enterococcus faecium: gram (+), vi khuẩn gõy bệnh viờm ủường tiết niệu, viờm ruột thừa, viờm màng trong tim, viờm màng nóo. [35]
1.6.1.2. Mụi trường nuụi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi khuẩn; SAB, SA cho nấm.
1.6.1.3. Cỏch tiến hành
- Pha loóng mẫu thử: Mẫu ban ủầu ủược pha loóng trong DMSO và nước cất vụ trựng thành một dóy 05 nồng ủộ thớch hợp theo yờu cầu và mục ủớch thử. Nồng ủộ thử cao nhất là 128 àg/ml, tiếp theo là 32 àg/ml, 8àg/ml, 2àg/ml, 0,5àg/ml
- Thử hoạt tớnh: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng ủộ 5.105CFU/ml khi tiến hành thử. Lấy 10ul dung dịch mẫu thử theo cỏc nồng ủộ ủó ủược pha loóng, thờm 200ul dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37oC. Sau 24h, ủọc giỏ trị MIC bằng mắt thường. Giỏ trị MIC ủược xỏc ủịnh tại giếng cú nồng ủộ chất thử thấp nhất gõy ức chế hoàn toàn sự phỏt triển của vi sinh vật. Giỏ trị IC50 ủược tớnh toỏn dựa trờn số liệu ủo ủộ ủục tế bào bằng mỏy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
- Chất tham khảo
Khỏng sinh Ampicillin cho cỏc chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng E.c với giỏ trị IC50 trong khoảng 0,05-2àg/ml.
Khỏng sinh streptomycin cho chủng Pa với giỏ trị IC50 trong khoảng 10-15 àg/ml.
Amphotericin B cho nấm với giỏ trị IC50 trong khoảng 0,5-1 àg/ml.
- Xử lớ kết quả
Giỏ trị MIC ủược xỏc ủịnh tại giếng cú nồng ủộ chất thử thấp ức chế hoàn toàn sụ phất triển của vi sinh vật.
Giỏ trị IC50 ủược tớnh toỏn dựa trờn số liệu ủo ủộ ủục của mụi trường nuụi cấy bằng mỏy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
Giỏ trị MBC ủược xỏc ủịnh bằng số khuẩn lạc trờn ủĩa thạch. [19], [29], [35]
1.6.2 Giới thiệu về ngụ, protein, proteaza và α-amilaza
1.6.2.1. Sơ lược về ngụ
Ngụ cú tờn khoa học là Zea mays, cú giỏ trị kinh tế về nhiều mặt: dựng làm lương thực cho con người, làm thức ăn chăn nuụi gia sỳc, dựng làm
thực phẩm (bao tử ngụ), ủặc biệt ngụ cũn cung cấp nguyờn liệu cho ngành cụng nghiệp. Do ủú ngụ ủó trở thành cõy trồng quan trọng.
Trờn thế giới, ngụ là một trong những cõy ngũ cốc quan trọng, diện tớch ủứng thứ 3 sau lỳa mỡ và lỳa nước; sản lượng thứ hai và năng suất cao nhất trong cỏc cõy ngũ cốc. Năm 1961, diện tớch ngụ toàn thế giới ủạt 105,5 triệu ha, năng suất 19,4 tạ/ha, sản lượng 205 triệu tấn, ủến năm 2009, diện tớch trồng ngụ thế giới ủạt khoảng 159,5 triệu ha, năng suất bỡnh quõn 51,3 tạ/ha, sản lượng 817,1 triệu tấn. Trong ủú Mỹ, Trung Quốc, Braxin là những nước ủứng ủầu về diện tớch và sản lượng.
Ở Việt Nam, ngụ là cõy lương thực quan trọng thứ hai sau cõy lỳa và là cõy màu quan trọng nhất ủược trồng ở nhiều vựng sinh thỏi khỏc nhau, ủa dạng về mựa vụ gieo trồng và hệ thống canh tỏc. Cõy ngụ khụng chỉ cung cấp lương thực cho người, vật nuụi mà cũn là cõy trồng xúa ủúi giảm nghốo tại cỏc tỉnh cú ủiều kiện kinh tế khú khăn. Sản xuất ngụ cả nước qua cỏc năm khụng ngừng tăng về diện tớch, năng suất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tớch ngụ là 730.000 ha, ủến năm 2005 ủó tăng trờn 1 triệu ha; năm 2010, diện tớch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ngụ cả nước 1126,9 nghỡn ha, năng suất 40,9 tạ/ha, sản lượng trờn 4,6 triệu tấn. Tuy vậy, cho ủến nay sản xuất ngụ ở nước ta phỏt triển chưa tương xứng với tiềm năng, chưa ủỏp ứng ủược nhu cầu tiờu dựng trong nước, hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu từ trờn dưới 1 triệu tấn ngụ hạt.
Hạt ngụ ủược cấu tạo bởi tinh bột, chất ủạm, chất bộo, chất xơ, chất khoỏng, ngoài ra cũn chứa cỏc loại enzim ủiều khiển mọi quỏ trỡnh sinh húa xảy ra trong hạt. [8]
Ngụ là loại cõy hàng năm ra quả một lần, thường phỏt triển vào mựa xuõn. Vũng ủời thay ủổi tựy theo ủiều kiện sống. Thời kỳ sinh trưởng và phỏt triển của ngụ qua 13 thời kỳ: trương hạt; nảy mầm; nhỳ mầm; thời kỳ lỏ thứ ba; thời kỳ lỏ thứ năm; thời kỳ ủẻ nhỏnh; thời kỳ ủậm thõn; thời kỳ lỏ thứ 7, thứ 9 và lỏ thứ 11; thời kỳ trổ cờ; thời kỳ phun rõu; thời kỳ chớn sữa, chớn sỏp và cuối cựng là thời kỳ chớn hoàn toàn. Trong ủú thời kỳ nảy mầm là nhạy cảm nhất với tỏc ủộng bờn ngoài. Thời kỳ này cú ý nghĩa quan trọng, quyết ủịnh sự sinh trưởng, phỏt triển dẫn ủến năng suất của ngụ. Chớnh vỡ vậy mà chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm thăm dũ ảnh hưởng của phức chất [Ho(tryp)3]Cl3.3H2O, [Er(tryp)3]Cl3.3H2O ủến sự nảy mầm, phỏt triển mầm, rễ của hạt ngụ. [4]
1.6.2.2. Giới thiệu về protein, proteaza và α-amilaza
* Protein: là cỏc polime cú khối lượng phõn tử lớn, chủ yếu bao gồm cỏc L-amino axit kết hợp với nhau qua liờn kết peptit. Protein là thành phần khụng thể thiếu ủược của tất cả cỏc cơ thể sinh vật nhưng lại cú tớnh ủặc thự cao cho loài, từng cỏ thể của cựng một loài, từng cơ quan, mụ của cựng một cỏ thể. Protein rất ủa dạng về cấu trỳc và chức năng, là nền tảng về cấu trỳc và chức năng của cơ thể sống. Cú thể kể ủến một số chức năng quan trọng của protein như: xỳc tỏc, vận tải chuyển ủộng, bảo vệ, truyền xung thần kinh, ủiều hũa, kiến tạo chống ủỡ cơ học, dự trữ năng lượngẦ
Tất cả cỏc protein ủều chứa cỏc nguyờn tố C, H, O, N, một số cũn cú một lượng nhỏ S. Ngoài cỏc nguyờn tố trờn, protein cũn chứa một lượng rất ớt cỏc nguyờn tố khỏc như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca, Ầ . [2]
*Proteaza: (peptit Ờ hidrolaza) xỳc tỏc quỏ trỡnh thủy phõn liờn kết peptit (-CO-NH-)n trong phõn tử protein, polypeptit ủến sản phẩm cuối cựng là cỏc axit amin. Ngoài ra, nhiều proteaza cũng cú khả năng thủy phõn liờn kết este và vận chuyển axit amin.
Proteaza cần thiết cho cỏc sinh vật sống, rất ủa dạng về chức năng từ mức ủộ tế bào, cơ quan ủến cơ thể nờn ủược phõn bố rất rộng rói trờn nhiều ủối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virut) ủến thực vật (ủu ủủ, dứaẦ) và ủộng vật (gan, dạ dày bờẦ). Trong cơ thể, cỏc proteaza ủảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt húa zymogen, ủụng mỏu và phõn hủy sợi fibrin của cục mỏu ủụng, giải phúng hormon và cỏc peptit cú hoạt tớnh sinh học từ cỏc tiền chất, vận chuyển protein qua màngẦNgoài ra, cỏc proteaza cú thể hoạt ủộng như cỏc yếu tố phỏt triển của cả tế bào ỏc tớnh và tế bào bỡnh thường ủú là tăng sự phõn chia tế bào, sinh tổng hợp ADNẦ[3]
* α-amilaza: được tỡm thấy trong hạt cõy một và hai lỏ mầm, ủược chia thành 2 loại: α- amilaza và β-amilaza. Cơ chất của chỳng là tinh bột và oligosacharide.
α -amilaza thuộc nhúm hiủrolase cú trong cơ thể ủộng vật (nước bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hoà thảo nảy mầm), nấm mốc, vi khuẩn. α- amilaza phõn giải cỏc liờn kết 1,4- glicozit ở giữa chuỗi mạch polisaccazit tạo thành cỏc ủextrin phõn tử thấp. Do ủú dưới tỏc dụng của enzim này làm dung dịch tinh bột nhanh chúng bắt màu với dung dịch iốt và bị giảm ủộ nhớt mạnh, ion canxi cú tỏc dụng làm bền cấu trỳc khụng gian của phõn tử enzim. α - amilaza tương ủối bền với nhiệt hơn so với cỏc amilaza khỏc và kộm bền với cỏc axit .
Trong ủề tài này, chỳng tụi khảo sỏt ảnh hưởng của một số phức chất tổng hợp ủược ủến hàm lượng protein, proteaza và α Ờ amilaza.[5]
Chương 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Húa chất và thiết bị
2.1.1. Húa chất
2.1.1.1. Dung dịch ủệm pH = 4,2 (CH3COONH4, CH3COOH)
Lấy 3,99ml CH3COOH 60,05%, d=1,05 g/ml hũa tan vào 150ml nước cất hai lần trong bỡnh ủịnh mức 250ml. Lấy 0,5ml NH3 25%, d=0,88 g/ml hũa tan trong 40ml nước cất hai lần rồi cho vào bỡnh ủịnh mức trờn, thờm nước cất hai lần ủến vạch ủịnh mức ta ủược dung dịch ủệm cú pH = 4,2 (kiểm tra lại bằng mỏy ủo pH). [7]
2.1.1.2. Dung dịch asenazo (III) 0,1%
Cõn một lượng chớnh xỏc asenazo (III) theo tớnh toỏn trờn cõn ủiện tử 4 số. Dựng nước cất hai lần hũa tan sơ bộ, nhỏ từng giọt Na2CO3 0,1% cho ủến khi dung dịch cú màu xanh tớm. đun núng hỗn hợp ở 60oC, tiếp theo nhỏ từng giọt axit HCl loóng cho ủến khi dung dịch cú màu tớm ủỏ và ủịnh mức ủến thể tớch cần thiết. [7]
2.1.1.3. Dung dịch DTPA 10-3M ( ủietylen triamin pentaaxetic)
Cõn lượng chớnh xỏc một lượng DTPA (M=393,35 g.mol-1) theo tớnh toỏn trờn cõn ủiện tử 4 số, hũa tan bằng nước cất hai lần, ủịnh mức ủến thể tớch cần thiết.
2.1.1.4. Dung dịch LnCl3 10-2M (Ln: Ho, Er)
Cỏc dung dịch này ủược ủiều chế từ cỏc oxit tương ứng như sau: cõn chớnh xỏc một lượng oxit Ho2O3, Er2O3 theo tớnh toỏn trờn cõn ủiện tử 4 số, hũa tan bằng dung dịch axit HCl 1N (ủược pha từ ống chuẩn). Cụ cạn trờn bếp cỏch thủy ở 80oC, sau ủú hũa tan bằng nước cất hai lần và ủịnh mức ủến thể tớch xỏc ủịnh. Dựng phương phỏp chuẩn ủộ complexon với chất chuẩn là DTPA 10-3M, thuốc thử asenazo (III) 0,1%, ủệm pH = 4,2 ủể xỏc ủịnh lại nồng ủộ ion ủất hiếm. [16]
2.1.1.5. Dung dịch DMSO (ủimetyl sunphoxit) 10-3M
Lấy một thể tớch xỏc ủịnh dung dich DMSO 98% theo tớnh toỏn, hũa tan và ủịnh mức bằng nước cất hai lần ủến thể tớch cần thiết.
2.1.1.6. Thuốc thử Folin-Xiocanto