II.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là chủng virut cúm gia cầm H5N1 đã được bất hoạt trong dung dịch trizol do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
II.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
II.2.1. Tách chiết ARN tổng số
Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân huỷ bởi enzym RNaza có mặt khắp mọi nơi, ngay cả trên ngón tay của người thao tác. Phân tử RNaza có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân làm mất hoạt tính của chúng. Vì vậy việc tách chiết ARN đòi hỏi phải thận trọng để tránh mọi sự tạp nhiễm RNaza từ môi trường. Thao tác phải trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hoá chất đều được xử lý DEPC trước khi đem khử trùng bằng áp lực hơi nước.
Có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tách chiết ARN của virut cúm H5N1, v trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp hoá học của Chomezynski và Sachi, Anal. Biochem. (1987), 156-159.
Các bước tiến hành:
Bổ sung 200 µl dung dịch chloroform vào huyền dịch virut đã được bất hoạt trong trizol (400 µl dịch virut trong 400 µl trizol), đảo đều trong 15 giây.
Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó đem ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C.
Chuyển pha trên vào một ống Eppendorf mới.
Bổ sung 0,5 ml isopropanol. Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 12000v/p trong 10 phút ở 40C để thu tủa ARN.
Rửa tủa lại bằng ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 5 phút ở 40C. Làm khô ARN trong Box, hoà lại trong 20 µl nước siêu sạch, đã được xử lý bằng DEPC để loại RNaza.
II.2.2. Kiểm tra ARN tổng số bằng quang phổ kế
Để có thể xác định tương đối nồng độ của ARN tổng số tách từ huyền dịch cúm H5N1, chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pirimidin. Nồng độ ARN sợi đơn (µg/ml) sẽ được tính theo công thức CARN = A260 x 40 x d, trong đó d là độ pha loãng mẫu cần đo.
Cách tiến hành như sau:
Dung dịch ARN thu được, được đem pha loãng 20 lần trong nước siêu sạch (5 µl dung dịch ARN trong 95 µl nước).
Chuyển dung dịch ARN đã được pha loãng sang cóng thạch anh nhỏ của máy quang phổ Shimadzu và đo sự hấp thụ ở bước sóng 260 nm.
Tuy nhiên cách tính trên chỉ chính xác nếu ARN thu được là sạch. Nếu dung dịch còn chứa protein thì protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm, do đó làm sai lệch nồng độ thật của ARN trong mẫu. Muốn biết việc xác định nồng độ ARN có chính xác hay không, cần đo thêm giá trị A280 (protein hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 280 nm). Nếu tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1.8-2 thì mẫu tách chiết ARN được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ sạch để tiến hành tiếp những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.
II.2.3. Phương pháp tạo cADN bằng phản ứng RT-PCR
Để thực hiện phản ứng RT-PCR chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm SuperScipt one-step RT-PCR with Platium Tag của hãng Invitrogen.
Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR: Tổng hợp cADN từ ARN của virut nhờ enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) và mồi ngẫu nhiên (random primer).
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị mẫu với thành phần như sau: ARN tổng số (tối ưu là 5 µg) : 5 µl Mồi ngẫu nhiên (50 ng/µl) : 3 µl
dNTP (10 mM) : 1 µl
H2O đã xử lý DEPC : 1 µl
Tổng thể tích : 10 µl
Sau đó ủ ở 650C trong 5 phút và đặt trên đá ít nhất 1 phút. Đồng thời chuẩn bị một hỗn hợp khác với các thành phần như sau:
10X RT buffer : 2 µl 25 mM MgCl2 : 4 µl 0.1 M DTT : 2 µl Chất ức chế RNaza : 1 µl Tổng thể tích : 9 µl
Bổ sung 9 µl hỗn hợp thành phần trên vào 10 µl mẫu đã được xử lý ở trên. Sau đó đảo đều và ly tâm 3000 v/p trong 30 giây.
Ủ hỗn hợp này ở 250C trong 2 phút.
Bổ sung 1 µl (50 units) SuperScriptTMII RT vào mỗi phản ứng, đảo đều sau đó đưa vào máy PCR với chu trình nhiệt như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
25oC trong 10 phút. 420C trong 50 phút. 700C trong 15 phút. 40C, thời gian = ∞.
Bổ sung 1 µl RNaza H vào mỗi mẫu và ủ ở 370C trong 20 phút để loại bỏ ARN. Trong thành phần lúc này là các sợi đơn cADN có kích thước khác
nhau và cADN sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp nên những đoạn ADN đích bằng cặp mồi đặc hiệu bằng phương pháp Real-time PCR.
II.2.4. Chuẩn bị mồi đặc hiệu cho phản ứng khuếch đại
Để chẩn đoán cúm A, chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN có kích thước … thuộc gen mã hoá protein nền (kí hiệu M) của virus cúm, nằm trong vùng bảo thủ của gen M của virus cúm A.
Khi đã được xác định là cúm typ A, để chẩn đoán phân typ cúm H5 chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đoạn ADN thuộc gen mã hoá kháng nguyên HA, cặp mồi được thiết kế nằm trong vùng bảo thủ của gen H5 của virus cúm A.
Thông tin về các cặp mồi được hiển thị trên bảng …. Cặp mồi số Tên mồi Tm Trình tự mồi Kích thước sản phẩm PCR (bp) 1 MP MM 2 H5M H5P
II.2.5. Chuẩn bị mẫu dương tính chuẩn cho chẩn đoán cúm H5N1
Chúng tôi đã thành công trong việc tách dòng gen mã hoá protein nền (gen M) của virut cúm A và gen mã hoá kháng nguyên HA (gen H) của phân typ H5N1, thông qua vectơ tách dòng pCR→2.1 của hãng Invitrogen.
Gen M và gen H đã được tách dòng ở trên , sẽ được làm mẫu dương tính chuẩn cho chẩn đoán phân typ H5N1 thuộc virus cúm typ A.
Mẫu chuẩn dương tính này sẽ khẳng định chính xác hơn đối với các mẫu dương tính và hạn chế các trường hợp dương tính giả.
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong tối (ánh sáng có thể làm mất hoạt tính phát huỳnh quang của SYBR→ Green I dye).
Phản ứng khuếch đại là cực nhạy, nên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng, luôn đeo găng tay và thao tác cẩn thận để tránh tạp nhiễm từ môi trường ngoài.
Chẩn đoán cúm gia cầm H5N1bằng SYBR→ Green I dye Real-time PCR: Đoạn gen có kích thước …bp thuộc gen M và một đoạn gen có kích thước …bp thuộc gen H được khuếch đại nhờ cặp mồi đặc hiệu tương ứng là MM, MP và HM, HP.
Ta tiến hành phản ứng khuếch đại để chẩn đoán …mẫu được nghi ngờ là dương tính. Phản ứng Real-time PCR là cực nhạy, do vậy để tránh trường hợp dương tính giả, ta thiết lập một mẫu dương tính chuẩn và một mẫu âm tính (non-template control). Thành phần phản ứng Thành phần Thể tích H2O vô trùng Buffer dNTP cADN Mồi xuôi Mồi ngược
AmpliTaq Gold DNA Polymerase Tổng thể tích
Sau khi mix mẫu, ta chia đều vào các ống mao quản và bổ sung ADN đích khác nhau vào từng ống, gắn ống mao quản lại, đặt vào rotor, ly tâm và cuối cùng đặt vào máy Real-time PCR.
Bước 1: 950C trong 6 phút. bước 2: 950C trong 10 giây. Bước 3: 580C trong 10 giây. Bước 4: 720C trong 10 giây.
Bước 5: lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4.
Bước 6: xác định Tm nhờ đường cong phân ly bằng cách tăng nhiệt độ chậm từ 600C – 95oC trong 20 phút đồng thời đo sự thay đổi của mức độ phát huỳnh quang của SYBR Green.
Phản ứng khuếch đại được giám sát từ khi phản ứng khuếch đại diễn ra cho đến khi kết thúc, thông qua một hệ thống camera theo dõi tín hiệu phát huỳnh quang từ mỗi ống.
Với bước đầu sử dụng kỹ thuật Real-time PCR trong phòng thí nghiệm, để khẳng định hơn nữa kết quả của phản ứng khuếch đại ta có thể kiểm tra lại kết quả bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
II.2.7. Phương pháp điện di ADN trên gel agaroza 1%
Nguyên tắc: axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường thì các phân tử này sẽ chuyển động theo hướng từ cực âm sang cực dương. Khả năng dịch chuyển của các phân tử axit này phụ thuộc vào hai yếu tố chính:kích thước, trọng lượng phân tử và nồng độ chất cấu thành nên gel.
Chuẩn bị gel agaroza: cân 1 g agaroza và bổ sung vào đó 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agaroza tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch agaroza này vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 1 giờ, khi gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đêm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 2 mm.
Tra mẫu ADN: Lấy mẫu chứa khoảng 1-2 µl ADN pha trong 16 µl đêm TE rồi trộn với 4 µl đệm màu 5X (chất này vừa có tác dụng tạo mầu quan sát,
vừa có tác dụng lắng mẫu xuống đáy giếng trước khi chạy điện di) và sau đó tra mẫu vào các giếng nhỏ trong bản gel. Một lượng ADN λ tương ứng đã được cắt phối hợp bằng Hind III và EcoR I cũng được tra vào gel để làm chỉ thị phân tử.
Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 100 V, với thời gian 25-30 phút. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào cần ngừng điện di.
Nhuộm ADN bằng EtBr: gel agaroza sau khi chạy điện di được nhuộm bằng dung dịch EtBr (2µg/ml) trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Gen Doc Pharmacia).
KẾT LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả tách chiết ARN tổng số
Mẫu virus cúm gia cầm H5N1 không phải được tách từ dịch nuôi cấy, mà được tách từ dịch tỵ hầu của bệnh nhân và sau đó huyền dịch virut được bất hoạt bằng trizol (Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp), nên có thể lượng ARN tổng số thu được là thấp.
Để đánh giá sơ bộ nồng độ ARN tổng số, chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế. Dung dịch ARN được pha loãng 20 lần trong nước siêu sạch đã được xử lý DEPC để loại bỏ RNaza và xác định độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm. Kết quả được nêu trong bảng sau:
Bảng . Kết quả kiểm tra ARN bằng quang phổ kế
A260 A280 A260/A280 CARN
Theo kết quả trên thì mẫu ARN tổng số được tách từ virut cúm H5N1 có tỷ số A260/A280 = , tức là đạt yêu cầu về độ sạch cho các nghiên cứu sinh học phân tử tiếp theo.
Chất lượng của ARN tổng số thu được ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng RT-PCR để tạo cADN. Vì vậy chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 1% để đánh giá độ sạch, cũng như chất lượng của ARN tổng số thu được.
Kết quả cho thấy ARN tổng số đã tách đạt tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng RT-PCR.
Kết quả chẩn đoán cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp Real-time PCR:
Sử dụng phương pháp Real - Time RT-PCR ta có thể chẩn đoán nhanh và chính xác cúm gia cầm phân typ H5N1 thuộc virus cúm typ A. Qua tìm hiểu chúng tôi biết rằng bộ kit cho Real – Time RT- PCR rất đắt. Vì vậy,chúng tôi tận dụng bộ Kit Super One- Step RT-PCR để tiến hành phản ứng phiên mã ngược nhờ mồi ngẫu nhiên (random primer) để tạo cADN có kích thứơc khác nhau. Sau đó dùng cDNA này làm khuôn để nhân
bản đoạn gen có kích thứơc …bp thuộc gen mã hoá protein nền M và nhân bản đoạn gen có kích thước ..bp thuộc gen mã hoá kháng nguyên bề mặt HA bằng Real - Time PCR.
Gen M mã hoá cho protein nền (protein nền mang kháng nguyên đặc hiệu typ, do đó được sử dụng để chẩn đoán virut cúm typ A) đã được tách dòng và giải trình tự. So sánh với trình tự của gen M đã được đăng ký trong Ngân Hàng Gen Quốc tế, tìm ra vùng gen ít biến đổi thuộc gen M của virut cúm typ A, từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu để câu đoạn gen này. Vùng gen ít biến đổi của gen M. Gen mã hoá kháng nguyên bề mặt HA (là kháng nguyên đặc hiệu phân typ, do đó được sử dụng để chẩn đoán cúm phân typ H5N1) đã được tách dòng và giải trình tự. Sau khi giải trình tự chúng tôi đã phân tích và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen quốc tế và thấy đoạn gen mà chúng tôi giải mã được, chính là đoạn gen mã hóa cho HA của virus cúm H5N1 gây bệnh trên gia cầm. Đoạn gen H5 của virut cúm gây bệnh ở người Vịêt Nam đã được đăng ký trong ngân hàng gen quốc tế với số đăng ký AJ715872. Chúng tôi cũng đã so sánh trình tự nucleotide đoạn gen H5 phân lập từ bệnh nhân Việt Nam với đoạn gen H5 phân lập từ gà tại Việt Nam (với số đăng ký AY574187) và nhận được sự tương đồng đạt 98,2%. Tìm ra vùng gen bảo thủ của gen H5 của virut cúm phân typ H5N1, từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu để câu vùng gen này. Trong phản ứng này chúng tôi sử dụng chất hoá học SYBR→ Green I dye có đặc tính là không phát quang ở trạng thái tự do, chỉ khi gắn với DNA sợi kép nó mới phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích. Nhờ hoạt tính này, chúng tôi sử dụng để phát hiện sản phẩm PCR được khuếch đại và tín hiệu phát huỳnh quang sẽ tăng dần sau mỗi chu kỳ khuếch đại do số lượng bản sao tăng lên.
Kết quả trên cho thấy chỉ ở các mẫu dương tính giá trị Delta Rn (biểu thị giá trị huỳnh quang thu được sau khi trừ đi tín hiệu nền của mẫu âm tính không bổ sung DNA) nhìn chung tăng lên rất nhanh bắt đầu từ chu kỳ ? (giá trị này gọi là Ct)
Ct là ngưỡng chu kỳ (cycle threshold) phản ánh số chu kỳ cần thiết để tất cả các đường cong vượt qua tín hiệu nền.
Kỹ thuật Real -Time – PCR với SYBR Green còn cho phép phân tích được sự xuất hiện của sản phẩm đặc hiệu, không đặc hiệu cũng như ảnh hưởng nhiễu của hiện tượng mồi tự bắt cặp tạo dạng dimer.
Hiện nay, Việt nam đã tạo được vắc xin, thuốc trong phòng chống bệnh cúm typ A/H5N1 và cũng có những phác đồ điều trị bệnh cho các bệnh nhân mắc cúm A/H5N1.
Thuốc Arbidol (Fludon H1) do Việt Nam sản xuất là thuốc kháng virus có tác dụng điều trị cúm H1N1 và H5N1 tương tự như Tamiflu và
Zanamivir hiện nay.
Nhóm nghiên cứu do tiến sĩ Nguyễn Hải Nam, Trưởng Khoa Hóa Dược của Đại học Dược Hà Nội làm cố vấn khoa học vừa công bố hoàn tất nghiên cứu độ ổn định và xây dựng quy trình sản xuất Arbidol (Fludon H1). Các chuyên gia cho rằng, việc sử dụng Arbidol (Fludon H1) do Việt Nam tự sản xuất vào điều trị cúm A/H1N1 hiện nay sẽ góp phần chủ động nguồn thuốc điều trị, giảm được số ca mắc cúm A/H1N1 đang gia tăng, nhất là trong bối cảnh khan hiếm thuốc Tamiflu như hiện nay.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học phan tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
2. Lê Đình Lương (2001), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
3. Lê Đình Lương và Phan Cự Nhân (2001), Cơ sở Di truyền học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
4. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Khuất Hữu Thanh, Nxb KHKT, 9/2006
5. Kỹ thuật gen – Nguyên lý và ứng dụng, Khuất Hữu Thanh, nxb Khoa học kỹ thuật, 2006
6. http://www.impe-qn.org.vn