II. Thành phần và cấu tạo hĩa học của acid nucleic
2. RNA
2.2. RNA vận chuyển (Transfer RNA tRNA)
Mỗi tRNA gắn với một phân tử amino acid, mang đến ribosome để tham gia tổng hợp protein. Mỗi tRNA đặc hiệu cho một loại amino acid. Cĩ hơn 20 loại tRNA khác nhau tương ứng với hơn 20 loại amino acid. Trong thực tế, người ta thấy số lượng tRNA lớn hơn rất nhiều so với số lượng amino acid vì một amino acid cĩ nhiều bộ ba mã hĩa. Đồng thời cùng một bộ ba mã hĩa, vẫn cĩ thể cĩ nhiều tRNA do hiện tượng biến đổi của các nucleotide trong tRNA tạo nên các loại tRNA mới và trong quá trình tổng hợp tRNA, sau khi hình thành chuỗi polynucleotide cịn chịu sự tác động của các yếu tố của mơi trường nội và ngoại bào làm các nucleotide bị biến đổi, tạo ra các tRNA mới.
Các tRNA cùng tham gia vận chuyển một acid amin là các izoaceptor. Số lượng izoaceptor thay đổi tùy acid amin.
Cấu trúc bậc I của tRNA: tRNA vận chuyển cĩ phân tử lượng nhỏ: 25.000-30.000, gồm 75-90 nucleotide, cĩ hằng số lắng 4S. Trong thành phần cấu trúc của tRNA cĩ khoảng 10% các nucleotide hiếm với khoảng 30 loại khác nhau. Mọi cấu trúc của tRNA đều cĩ 2 đầu 5' và 3' giống nhau: đầu 5' luơn chứa G với gốc P tự do, cịn đầu 3' luơn cĩ 3 nucleotide là CCA 3'-OH. Nhĩm 3'-OH của A cĩ thể liên kết với acid amin để tạo phức hợp tRNA-aminoacyl.
Chuỗi polynucleotide cuộn lại cĩ những đoạn tạo mạch xoắn kép, hình thành cấu trúc bậc hai của tRNA.
Hình 1.13 Cấu trúc của tRNA
Enzyme aminoacyl tRNA synthetase gắn amino acid với tRNA tương ứng. Mỗi enzyme đặc hiệu cho một loại amino acid riêng biệt và xúc tác phản ứng gắn với tRNA của nĩ nhờ năng lượng ATP tạo ra aminoacyl tRNA. Phức hợp aminoacyl tRNA đến ribosome gắn với mRNA bằng nhờ các bộ ba đối mã (anticodon) trên tRNA bắt cặp bổ sung với các bộ ba mã hĩa (codon) trên mRNA.
Các tRNA cĩ một số đặc tính cấu trúc chung: chiều dài khoảng 73- 93 nucleotide, cấu trúc gồm một mach cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử. Đầu mút 3’ cĩ trình tự kết thúc là CCA, amino acid luơn gắn vào đầu này. Đầu 5 chứa gốc phosphate của G.
Mỗi tRNA cĩ cĩ 4-5 vùng với chức năng khác nhau:
- Vịng DHU: cĩ chứa nucleotide dihydrouridin, vùng này cĩ chức năng nhận biết aminoacyl tRNA synthetase
- Vịng anticodon: đọc mã trên mRNA theo nguyên tắc kết cặp anticodon – codon.
- Vịng phụ: cĩ thể khơng cĩ ở một số RNA.
- Vịng TφC: cĩ chứa nucleotide pseudouridin, vùng này cĩ chức năng nhận biết ribosom để vào đúng vị trí tiếp nhận aminoacyl tRNA (vị trí A)
- Đấu 3’ –CCA: vị trí gắn với acid amin. tRNA chiểm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào 2.3. RNA thơng tin (messenger RNA – mRNA)
RNA thơng tin làm nhiệm vụ truyền đạt thơng tin di truyền từ DNA đến protein. mRNA chiểm khoảng 5% tổng số RNA tế bào.
Cấu trúc của mRNA:
5’ m7GxpYp AUG UAG 3’
vùng 5’ vùng vùng 3’
khơng mã hĩa mã hĩa khơng mã hĩa X, Y cĩ thể là A hoặc G
DNA polymerase khởi sự phiên mã ở đoạn nằm ngay trước vùng mã hĩa được gọi là đoạn 5’ khơng mã hĩa (5’-non coding). Do đĩ mRNA cĩ đoạn đầu mang các tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã. Ở đuơi 3’ sau dấu kết thúc cĩ đoạn 3’ khơng mã hĩa là nới gắn poly-A.
Các mRNA của prokaryote cĩ nữa thời gian (half life) tồn tại ngắn trung bình 2 phút. Các mRNA của Eukaryote cĩ nữa thời gian tồn tại khoảng 30 phút - 24 giờ.
Hình 1.14 mRNA ở Prokaryote
Hình 1.15 mRNA ở eukaryote
2.4. Ribozym và self- splicing
Vào 1981, phát minh về vai trị xúc tác của một số phân tử RNA đã làm đảo lộn quan điểm về chất này.
Các phân tử rRNA của các lồi nguyên sinh động vật, lúc đầu được tổng hợp với một số lượng lớn tiền chất, từ số các rRNA này sẽ cĩ một được tạo ra bằng cách tự cắt nối (self - splicing). Quá trình cắt nối này cĩ thể xảy ra ở in vitro trong sự vắng mặt của protein. Điều đĩ cho thấy rằng các trình tự intron tự nĩ cĩ hoạt tính xúc tác tương tự enzyme. Phản ứng self-splicing trong đĩ trình tự intron tự xúc tác quá trình tự cắt rời khỏi phân tử rRNA ở lồi Tetrahymena qua 2 bước:
+ phản ứng được bắt đầu khi nucleotide G gắn vào trình tự intron, đồng thời cắt mạch RNA.
5’
Vị trí gắn Rb
Mã khởi đầu AUG
Vùng không mã hóa 3’ P1 UAA mã kết thúc P2 UAA mã kết thúc P3 UAA mã kết thúc
Mã khởi đầu AUG Mã khởi đầu AUG
Vị trí gắn Rb Vị trí gắn Rb P P P G 5’ 5’ CAP Vị trí gắn Rb Vùng không mã hóa AUG Mã kết thúc UAA Vùng không mã hóa A-A-A--3’
+ Đầu 3’ của RNA mới vừa được tạo ra gắn vào đầu bên kia của intron hồn thành phản ứng nối liền
Hình 1.16 Hoạt động cắt intron và nối exon trên mRNA
Trình tự intron dài 400 nucleotide đã được tổng hợp trong ống nghiệm và nĩ cuộn lại tạo phức hợp bề mặt cĩ hoạt tính tương tự enzyme trong các phản ứng với các RNA khác. Mặc dù splicing phần lớn khơng được thực hiện tự động như ở Tetrahymena nhưng hiện tượng này cũng được phát hiện ở những sinh vật khác, cả ở nấm và vi khuẩn.
Các RNA cĩ khả năng tự xúc tác được gọi là ribozyme. Phát hiện này cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc tìm hiểu cơ chế và nguồn gốc sự sống.
Hình 1.17 Phản ứng self-splicing của RNA
III Các tính chất của DNA
1. Biến tính (denaturation) và hồi tính (renaturation)
Hai mạch đơn của phân tử AND gắn với nhau nhờ các liên kết hydro.Khi đun nĩng DNA từ từ, vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80- 95oC), các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt và chúng tách rời nhau. Trước tiên các mối liên kết A-T, khi nhiệt độ > 90oC các liên kết G -C bị đứt. Đĩ là hiện tượng biến tính của DNA.
Nhiệt độ mà ở đĩ 2 mạch DNA tách rời nhau được gọi là điểm chảy melting poin) của DNA: Tm. Nhiệt độ này đặc trưng cho mỗi loại DNA, phụ
thuộc vào số lượng các liên kết hydro. DNA cĩ tỷ lệ G-C cao sẽ cĩ điểm chảy cao. DNA cĩ 60% G-C thì điểm chảy là 95oC.
Hình 1.18 Sự biến tính và hồi tính của DNA
Ngồi nhiệt độ, người ta cịn dùng chất formanide (NH2 -CH = 0) làm biến chất DNA ở 40oC
Các DNA bị biến chất được hạ nhiệt độ từ từ, ở 60o -700C các nucleotide sẽ gắn lại với nhau để tạo nên DNA mạch kép. Hiện tượng này gọi là hồi tính.
Cĩ thể biết được DNA bị biến tính hoặc chưa nhờ vào sự gia tăng hấp thụ tia cực tím khi bị biến tính và sự giảm hấp thu tia cực tím khi hồi tính. Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đơi chuyển thành mạch đơn, điều này xảy ra do “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect), hoặc dựa vào sự thay đổi độ lắng tụ trong ống nghiệm khi ly tâm.
2. Lai acid nucleic
Sử dụng đặc tính biến tính rồi hồi tính cĩ thể tiến hành lai DNA với DNA, DNA với RNA, RNA với RNA.
Nguyên tắc: lấy DNA A làm biến tính thành mạch đơn, trộn với DNA B cũng bị biến tính thành mạch đơn. Dung dịch được hạ nhiệt độ từ từ để xảy ra hồi tính. Đây là kiểu lai lỏng hay lai trong dung dịch. Quá trình hồi tính xảy ra, sợi A kết với A, B kết với B, đồng thời cĩ sợi A kết với B tạo thành phân tử lai. Muốn lai được với nhau, giữa 2 loại DNA phải cĩ những đoạn cĩ trình tự bổ sung nhau. Cĩ thể dùng đồng vị phĩng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai.
Hiện nay cịn sử dụng phương pháp lai trên pha rắn, được sử dụng rộng nhất:
+ Phương pháp Southern blot, dùng cho DNA + Phương pháp Northern blot dùng cho RNA
+ Phương pháp dot (điểm) và slot (khe) blot dùng cho RNA và DNA - Lai tại chỗ (in situ hybridization) là kiểu lai phân tử trong đĩ trình tự acid nucleic cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mơ. Lai tai chỗ cho phép nghiên cứu NST, khuẩn lạc hay mơ tế bào mà khơng cần tách chiết chúng.
Dùng phương pháp lai DNA:
+ Cĩ thể xác định mối quan hệ họ hàng giữa các lồi. DNA người và DNA chuột chỉ lai được 25%.
+ Cĩ thể tiến hành lai mRNA với DNA để xác định vị trí gen trên DNA tạo ra mRNA tương ứng.
Phương pháp lai acid nucleic giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nĩ là cơ sở của phương pháp chẩn đốn mới dùng acid nucleic đang đuợc sử dụng rộng rãi.
Hình 1.19 Phát hiện các DNA lai với mẫu dị
IV. Những cấu trúc chứa DNA trong tế bào
1. Những đoạn DNA chứa thơng tin di truyền
Đại phân tử DNA là do polynucleotide tạo thành, được chia làm nhiều đoạn. Mỗi đoạn là một đơn vị chức năng, gọi là gen
Gen được định nghĩa trong di truyền học:
+ Mendel là người đầu tiên nêu lên khái niệm “nhân tố di truyền” + J. Morgan cụ thể hĩa khái niệm về gen: gen nằm trên nhiễm sắc thể chiếm một locus nhất định. Gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng.
+ Sau khi học thuyết trung tâm ra đời: gen là đoạn DNA trên nhiễm sắc thể khơng những mã hĩa cho các loại protein mà cả các loại RNA.
+ Cuối những năm 70, sau khi phát hiện ra gen gián đoạn: gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptid nĩ bao gồm cả vùng trước và sau vùng mã hĩa cho protein và cả những đoạn khơng mã hĩa xen giữa các đoạn mã hĩa.
Hiện nay cĩ thể định nghiã tổng quát như sau: gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một locus nhất định trên NST và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hĩa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng trực tiếp cho
tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch polypeptid để gắn lại tạo ra các protein cĩ hoạt tính sinh học.
Tồn bộ những gen khác nhau của cơ thể, gọi là Idiotype. Ở Eukaryote nĩ bao gồm các gen trên nhiễm sắc thể (chromotype) và các gen ngồi nhân (plasmotype). Ở prokaryote, nĩ bao gồm bộ gen và plasmid.
2. Virus chứa DNA và virus chứa RNA
Virus gây bệnh đốm thuốc lá (mosaic tobacco virus - MTV) là virus chứa RNA sợi đơn. Nĩ là một hạt hình que dài 300 nm, cĩ đường kính 18 nm. Bên ngồi cĩ một vỏ chứa 2130 phân tử và một vịng xoắn RNA ở bên trong. Chiều cao vịng xoắn: 23Ao, khối lượng phân tử = 2.106 đvC.
Hình 1.20 Virus khảm thuốc lá
a. Ảnh virus khảm thuốc lá chụp bằng kính hiển vi điện tử ở
độ phĩng đại 37.428X
b. RNA điều khiển sự hình thành tính trạng vỏ của virus
Một số virus chứa DNA sợi đơi như các thực khuẩn thể T2, T4, T6
phân tử: 130.10 đvC. Khi lực thẩm thấu của mơi trường thay đổi đột ngột, phân tử DNA này thốt ra khỏi vỏ protein, người ta chụp ảnh được ảnh DNA của tjực khuẩn thể T2 với chiều dài 0,05 mm (50µm), phân tử này xếp gọn ở phần đầu của thực khuẩn thể. Tất cả thực khuẩn thể T số chẵn chứa DNA với mạch polynucleotide giống nhau, nên khi trộn lẫn các DNA mạch đơn đã bị biến tính của chúng với nhau thì các mạch đơn này cĩ thể tạo thành phân tử lai. Phân tử DNA của T3, T7 khơng thể hình thành phân tử DNA lai với DNA của T số chẵn. Cịn virus ΦX174 cĩ chứa DNA sợi đơn gồm 5400 nucleotide với khoảng 9 gen.
3. Nhiễm sắc thể chính và plasmid của vi khuẩn
DNA của vi khuẩn làm thành thể nhân, tiếp xúc trực tiếp với tế bào chất, khơng cĩ màng nhân làm giới hạn. DNA của thể nhân là DNA mạch vịng, xoắn kép
Ví dụ: DNA E.coli cĩ đường kính 350 µm, gồm 4.106 đơi nucleotide và chứa khoảng 500 gen xếp nối tiếp nhau thành chuỗi dài chi phối tất cả các hoạt động chức năng của sự sống.
Plasmid cũng là phân tử DNA mạch kép, dạng vịng ở bên cạnh thể nhân. Khối lượng phân tử trung bình khoảng 1% DNA của thể nhân.
Các plasmid cĩ thể gắn tạm thời hoặc vĩnh viễn ở trên NST chính của vi khuẩn. Cĩ thể tham gia sự tự nhân đơi và tham gia tiếp hợp khác như là một phần của NST chính.
4. Nhiễm sắc thể Eukaryota.
4.1 Các trình tự lặp lại và đơn độc
DNA được cắt thành từng đoạn nhỏ, cho biến tính, sau đĩ hồi tinh thì các đoạn cĩ trình tự bổ sung dễ tái tổ hợp với nhau hơn các đoạn khác. Nhờ vậy cĩ thể nhận biết được các trình tự lặp lại. Dựa vào đĩ phân DNA thành ba loại:
+ DNA đơn độc (tái hợp rất chậm)
+ DNA lặp lại trung bình (tái hợp nhanh vừa) + DNA lặp lại cao (tái hợp rất nhanh)
Mặc dù DNA mang thơng tin mã hĩa cho các protein nhưng trong thực tế chỉ cĩ khoảng 10% trong số 3 tỷ cặp nucleotide trong genome của người thực sự làm chức năng này. Căn cứ vào đặc điểm cấu trúc và phân, chia DNA thành các loại sau:
- DNA đơn độc (Single copy DNA)
Đây là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 75% genome. Các đoạn DNA này chỉ thấy 1 lần (hoặc vài lần) trong genome. Một phần nhỏ của DNA loại này là các gen mã hĩa cho protein. Hẫu hết các DNA đơn độc là các intron hoặc là các đoạn nằm xen giữa các gen.
- DNA lặp lại (repetitive DNA)
Chiểm 25% cịn lại của genome, đây là các đoạn DNA được lặp đi lặp lại hàng ngàn lần trong genome. DNA lặp lại gồm 2 loại:
+ DNA vệ tinh (satellite DNA): loại DNA tập trung ở 1 số vùng nhất
định trên NST, ở đĩ chúng xếp đuơi nhau, cái này tiếp cái kia. Loại này
chiếm 10% bộ gen.
+ DNA lặp lại rãi rác: loại DNA này chiếm khoảng 15% genome, gồm 2 loại:
Các yếu tố rãi rác cĩ kích thước ngắn SINEs (short interspersed repetitive elements): kích thước từ 90-500 bp. Trong nhĩm này cĩ loại DNA lặp lại tên Alu với kích thước khoảng 300 bp, mang đoạn DNA cĩ thể bị enzyme hạn chế Alu I cắt (đây là enzyme cĩ nguồn gốc từ vi khuẩn
Arthrobacter luteus). Đoạn lặp Alu là 1 họ bao gồm các đoạn DNA cĩ độ giống nhau cao, phân bố rãi rác khắp hệ gen với khoảng 300.000 bản sao, chiếm khoảng 2-3% tồn bộ DNA của người, chúng được xem như là các yếu tố vận động. Ở 2 đầu mỗi đoạn Alu cĩ các đoạn lặp cùng chiều ngắn khoảng 7-10 bp. Bên trong đoạn Alu cĩ các đoạn lặp dài khoảng 40 bp. Điểm đặc biệt của các đoạn lặp DNA này là cĩ thể tạo ra bản sao của mình và cĩ thể cài vào các phần khác của bộ gen. Hiện tượng này đơi khi cĩ thể làm gián đoạn một gen mã hĩa cho protein nào đĩ và gây ra tình trạng bệnh lý di truyền.
Vai trị của các trình tự Alu đến nay chưa rõ. Một điều đáng kinh ngạc là cĩ sự tương đồng (homologus) từ 80-100% giữa phần 3' của Alu với đầu mút 5' và 3' của RNA 7SL, là phần tương tác với các tín hiệu peptid trước khi vận chuyển ra tế bào chất. Việc xác định trình tự nucleotide của
Alu cho thấy cĩ ít nhất 6 nhĩm phụ và tất cả đều bắt nguồn từ DNA mã hĩa cho RNA 7SL.
Các yếu tố rãi rác cĩ kích thước dài LINEs (long interspersed repetitive elements): bao gồm các họ LINE 1 (hay Kpn 1) và THE 1. Các trình tự LINE cĩ chiều dài khoảng 6000-7000 bp với gần 5.000 bản sao nguyên vẹn và 100.000 bản sao từng phần rãi rác khắp bộ gen người. Chúng là những trình tự lặp lại khơng mã hĩa dài nhất và thường ở vùng giàu AT. Các bản phiên mã trình tự LINE gắn với protein tạo thành phức hợp ribonucleoprotein. Ở một dịng tế bào người bị ung thư (teratocarcinome), người ta quan sát thấy cĩ các ribonucleoprotein này. Sự xen đoạn LINE vào
