2. Enzyme glucose oxidase
2.1. Giới thiệu chung về enzyme glucose oxidase
Glucose oxidase (GOX) xúc tác quá trình oxy hóa của β-D-glucose thành D- glucono-δ-lacton và hydrogen peroxide. Nó là rất cụ thể cho β-D-glucose và không hoạt động trên α-D-glucose. Sử dụng chính của glucose oxidase được trong việc xác định miễn phí glucose trong các sản phẩm bodyfluids, thực phẩm và nông nghiệp. Tuy nhiên, nó đã được được sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp nướng bánh, nó oxy hóa hiệu quả kết quả trong bột nhão mạnh mẽ hơn. Trong một số ứng dụng có thể
được sử dụng để thay thế oxy hóa, chẳng hạn như Bromate và axit L-ascorbic. Các ứng dụng khác của glucose oxidase bao gồm việc loại bỏ oxy từ quá trình đóng gói thực phẩm và loại bỏ D - glucose từ lòng trắng trứng để ngăn chặn sự sậm màu.
Nó đã được đề xuất cho một kỹ thuật mà hệ thống enzyme thứ hai, tức là horseradish peroxidase (HRP) chỉ đơn giản là thêm vào hỗn hợp phản ứng khá tương tự như xét nghiệm về hóa học lâm sàng (Kuhlmann năm 1970; Kuhlmann và Avrameas 1971).
Trong sử dụng ban đầu của nó, nguyên tắc khuếch đại enzyme này thường đưa ra một hạn chế ở cấp độ kính hiển vi ánh sáng bằng cách nhuộm màu không chính xác với sự định hóa khuếch tán của các chi tiết di động. Hệ thống enzyme nhiều bước đã cho thấy rằng một hệ thống enzyme kết hợp chặt chẽ sẽ làm việc tốt hơn vì nó có một hiệu ứng tích lũy về hiệu quả của phản ứng tổng thể là đạt được (Mosbach và Mattiasson 1976). Vì vậy các bộ khuếch đại hệ thống thứ hai (HRP) ở gần của các enzyme đánh dấu (GOX) vào các phạm vi di động tương tự bằng cách miễn dịch hoặc cầu avidin-biotin, và do đó, nội địa hóa tuyệt vời của kháng nguyên có thể đạt được.
Tính hữu dụng và độ nhạy của phương pháp mới do đó được chứng minh bởi immunolocalization IgA trong amidan, fetoprotein-alpha ở gan và mô kháng nguyên polypeptide trong tuyến vú. Cho mục đích này, kháng thể gián tiếp lanelled và kháng thể kỹ thuật brigde bao gồm cả phương pháp avidin-biotin emploted.
2.2. Nguyên tắc hoạt động
Glucose oxidase xúc tác quá trình oxy hóa của β – D - glucose thành D – glucono - δ - lactone với việc xảy ra đồng thời của hydrogen peroxide. Trong sự hiện diện của peroxidase (POD) hydrogen peroxide (H2O2) tham gia vào một phản ứng thứ hai liên quan đến axit p-hydroxybenzoic và 4-aminoantipyrine với sự hình thành định lượng của một quinoneimine phức tạp thuốc nhuộm được đo ở 510 nm.
Các phản ứng có liên quan là:
2.3. Động học và cơ chế hoạt động enzyme glucose oxidase
Glucose Oxidase từ khuôn mẫu đã được nghiên
cứu bởi một số của người lao động. Enzyme xúc tác quá trình oxy hóa của β – D - glucose thành D - glucono – δ - lactone. Đặc trưng chất nền của nó đã được kiểm tra, và nó cũng tác động lên 2 -deoxy-glucose, D-mannose, D-galactose và D-xylose, mặc dù kết quả cho ba đường cuối cùng là rất thấp.
Cộng hưởng tín hiệu và sự xuất hiện hấp thụ quang phổ tương ứng với các hình thức enzyme trung gian giữa oxy hóa hoàn toàn và đầy đủ giảm flavin, cũng không làm giảm quá trình oxy hóa như trung gian các hình thức nhất thiết phải hoạt động một phần trong xúc tác. Do đó mỗi enzyme phải được kiểm tra một cách riêng biệt và các kết quả của sự cộng hưởng spin electron quang phổ tương quan với các nghiên cứu phản ứng nhanh chóng, thành lập có hoặc không có hình thức trung gian của enzyme phản ứng ở một giá trị đủ để có lợi cho hoạt động xúc tác của nó. Điện tử quay nghiên cứu cộng hưởng của glucose oxidase đã được báo cáo của Beinert và Sands và Mason et al. và trong khi kinh nghiệm trên glucose oxidase từ AspergiZZuns Iger trong tiến trình, Nakamura và Ogura xuất bản một bài báo quan trọng về động học của quá trình oxy hóa của glucose bởi các enzyme từ Penicillium arnagaskiense. Tóm lại, những bằng chứng này chỉ ra rằng các trung gian semiquinoid lợi ích một phần không dùng trong cơ chế xúc tác của glucose oxidase.
2.4. Phương pháp thực nghiệm
2.4.1. Vật liệu
Tinh khiết glucose oxidase (A. niger) được chuẩn bị từ Dee-Oconcentrate được thu từ Công ty Hóa chất Miles bằng cách sửa đổi phương pháp của Kusai. Catalase (thịt bò, gan) với 1.260 đơn vị Keilin mỗi g được thu thập từ Công ty L.Light, Bucks, England.
D - Glucose, D - galactose, D - xylose, D - mannose và D - glucono – δ - lactone được lấy từ nhà thuốc của Anh, Ltd, Poole, Dorset, Anh.
2 – deoxy - D – glucose (a grade, glucose free) được thu thập từ Tổng công ty California để nghiên cứu Sinh hóa.
a) Độ tinh khiết của Đường
Galactose, xylose, mannose thử nghiệm cho sự tinh khiết và đường nhiễm bẫn cả hai chromatographically và enzymically.
• Tăng dần sắc ký trên giấy trong một hệ thống bao gồm dung môi ethyl acetate
pyridin - nước (2: 1: 2 v / v) cho thấy không có nhiễm bẩn đường, nhưng rất nhỏ nhiễn bẩn của galactose với lactose. Tuy nhiên, glucose nhiễm bẩn dưới 1% gặp nhiều khó khăn để phát hiện bằng sắc ký.
• Tỷ lệ xúc tác quá trình oxy hóa bởi glucose oxidase glucose rất nhanh hơn nhiều so với quá trình oxy hóa của mannose, galactose, hoặc xylose. Nhiễm bẩn glucose không đáng kể có thể được phát hiện trong xét nghiệm sự đo áp, kể từ khi, nếu nồng độ phù hợp của một trong những các loại đường và enzyme được sử dụng, bất kỳ nhiễm bẩn glucose đáng kể tăng lên với tốc độ ban đầu nhanh chóng của sự hấp thu oxy, theo sau với tốc độ chậm liên tục, sự hấp thu do chủ yếu đường một mình. Tại 0,67 M, galactose, mannose và xylose được phát hiện là bị nhiễm bẩn bởi đường khoảng 0.2, 0.2 và 0.1 '%, tương ứng. (Một lô galactose có một ô nhiễm 2% với glucose và đã bị từ chối). D - glucono – δ - lactone đã được tìm thấy có khoảng 0.1% ô nhiễm ZO glucose.
b) Glucose - đường Mannose, Galactose, Xylose, Glucose
Được yêu cầu cho các thí nghiệm dòng chảy dừng lại kỵ khí. Nhiễm bẩn Glucose được giảm đến một mức độ không đáng kể enzymically bằng ủ đường bị ô nhiễm tại 350
trong 1 giờ trong không khí (bằng cách lắc) với một số lượng không đáng kể của glucose oxidase. Số lượng glucose oxidase được tính toán đủ để oxi hóa gần như tất cả các đường trong thời gian này, nhưng chưa đủ để chuyển đổi hơn 1% của các loại đường với các sản phẩm. Enaymic hoạt động chấm dứt khi các giải pháp đường kỵ khí được thực
hiện. Ngoài ra, galactose rất tinh khiết đã được chuẩn bị từ pentaacetylgalactose đã được recrystallized một số lần từ methanol. Dừng lại dòng chảy kết quả thu được galactose tinh khiết trong với đồng thuận tuyệt vời với những người thu được với enzymically galactose đã xử lý.
c) Bộ đệm
Trong các thí nghiệm dòng chảy cả manometric và dừng lại, 0.1 và 0.13 M sodium đệm phosphate, pH 5.6, được sử dụng. Keilin và Hartree sử dụng bộ đệm phosphate, pH 5.6, trong thí nghiệm của mình với glucose oxidase. Manometric thí nghiệm cũng đã được thực hiện với 0,1 M đệm natri acetate, pH 5.6, được sử dụng bởi các công nhân khác. Không có sự khác biệt trong kết quả đã được thu được với hai bộ đệm, mặc dù cả hai đều kết thúc của các dãy đệm tương ứng của họ.
Trong các thí nghiệm với glucono… đệm sodium phosphate 0.2M, pH 6.3 đã được sử dụng.
d) Nồng độ đo
Tất cả các giải pháp đường từ các chất rắn được phép mutarotate vào hỗn hợp cân bằng (hình thức α và β trước khi sử dụng trong các thí nghiệm động. Dữ lệu Kinetic trong bài báo này được thể hiện trong điều kiện đường tổng tập trung, mặc dù glucose oxidase là cụ thể cho β- glucose. Nồng độ enzyme được đo trong các điệu kiện của nó chứa đựng flavin. Trong các thí nghiệm dòng chảy dừng lại, giải pháp đã gọi là chứa đựng O2 đã được chuẩn bị bằng cách cân bằng áp suất khí quyển trong mạch mở và không khí trong phòng hoặc bằng cách cân bằng với oxy tinh khiết trong áp kế thủy tinh. Nồng độ oxy được tính toán từ các bảng độ hòa tan của nó. Bởi vì nồng độ cao của glucose làm suy giảm tính hòa tan của khí trong nước, như một quy tắc chung, giải pháp cân bằng enzyme với oxy, và glucose được giải thoát khỏi khí hoà tan bằng cách lắc và di tản. Các áp kế đã được lấp đầy với nitơ prepurified (Công ty Anh oxy, Wembley, Middlesex, Anh), và các giải pháp oxy đã được chuyển giao trực tiếp vào bộ máy dòng chảy dừng lại.
2.4.2. Phương pháp
Tiêu chuẩn Warburg áp kế được sử dụng. Tỷ lệ hấp thu oxy trong sự hiện diện của glucose oxidase và catalase tinh khiết (100 µg mỗi áp kế) được nghiên cứu trên một phạm vi nồng độ đường (0.1-0.01 M) tại pH 5.6, 00 và 250, và hàm lượng oxy khác nhau. Các khí không gian của áp kế đã được lấp đầy với một trong hai ôxy, không khí ( 21% oxy), 10,5% oxy. Nhìn chung, số lượng enzyme mỗi áp kế đã được điều chỉnh để oxy hấp thu không vượt quá 3µl mỗi phút. Các áp kế đã lung lay tại một tỷ lệ không đổi cho mỗi phút 150. Oxy hấp thu hơn 25 phút đã được sử dụng trong tính toán tỷ lệ hấp thu oxy, kể từ khi tỷ lệ này là liên tục cho thời gian này.
Gây ô nhiễm glucose (0,0002 IVR hoặc ít hơn) trong mannose, galactose, và xylose ở nồng độ 0,1 M đã được sử dụng rất nhanh chóng, mà chỉ có tỷ lệ trong 2 đến 5 phút đầu tiên lớn hơn ở lần sau. Trong thực tế, ở nồng độ thấp hơn 0.1 M đường, glucose ô nhiễm ngày càng trở nên khó khăn để phát hiện ở tất cả các. Tuy nhiên, hằng số tỷ lệ hấp thu oxy lần lớn hơn 5 phút sau khi trộn đã được sử dụng để tính mục đích.
b) Dừng dòng thí nghiệm
Đây là những thực hiện với bộ máy của Gibson và Milnes với việc sử dụng của một 2cm con đường ánh sáng. Đa số các thí nghiệm được thực hiện ở 450 µm với một nguồn ánh sáng vonfram, đối với một số người, trong vùng tử ngoại khu vực, 150-watt, dòng hồ quang xenon được sử dụng. Nếu glucose là vượt quá đủ lớn liên quan đến oxy để nồng độ của nó có thể được coi là không đổi trong suốt phản ứng, sau đó, cung cấp mà glucose phản ứng với một hình thức của loại enzyme có quang phổ của các enzyme bị oxy hóa, số lượng doanh thu bất kỳ ngay lập tức là tỷ lệ thuận với sự phối.
Hình 1: Sao chép dao động dấu vết thu được với dừng lại bộ máy dòng chảy trong sau phản ứng giữa glucose và oxy. Đồng thời thể hiện bằng mũi tên, một giải pháp enzyme ở trạng thái cân bằng với 1 bầu không khí của O2 được trộn với một bằng khối lượng của M & miễn phí đường 0.1. Phản ứng này đã được theo sau trong một con đường ánh sáng 2 cm tại 450 µm, 00 trong 0,13 M đệm phosphate, pH 5.6, nồng độ các men tiêu hóa là 1.17x10-5 M.
Tổng số lần enzyme phải chuyển giao khí thải oxy gia tăng có thể được tính từ các điều kiện của thí nghiệm, và con số này có thể tương đương với diện tích kèm theo như trong hình trên. Giá trị số tương ứng với một giá trị của phối có thể đượcđược tìm thấy bằng cách đo tỷ lệ trong tổng diện tích kèm theo giữa hai điều phối gần sự khởi đầu của đường cong, nơi tốc độ thay đổi của mật độ quang học nhỏ. Trên giả định rằng số lượng tương ứng của oxy đã được tiêu thụ trong khoảng thời gian giữa các điều phối ở một tỷ lệ không đổi tương ứng với mức trung bình của các điều phối đầu tiên và cuối cùng, giá trị tương ứng với một phối cụ thể có thể được được tìm thấy.
Kết quả với glucose ở 00 đã được trình bày trong hình dưới. Cơ chất của một chất kết tủa nghịch đảo đối ứng cho tăng song song như những đường trong hình. 1 có thể được tóm tắt trong bavhằng số: tỷ lệ với nồng độ vô hạn của cả hai nền (Vmax), và nồng độ của mỗi chất nền cần thiết để cung cấp cho một nửa tỷ lệ này tối đa trong sự hiện diện của một vô hạn nồng độ khác (KO2, và Kpiucose). Một số giá trị những số lượng được thu thập trong bảng sau:
Với 2 deoxyglucose, kết quả cũng tương tự như trong hình thức, nhưng giá trị số của các hằng số khác nhau rất nhiều. Với 2-
deoxyglucose, KO2 là quá nhỏ mà nó là khó khăn để xác định chính xác, Vmax ít hơn nhiều hơn so với glucose dưới điều kiện so sánh.
Các loại đường mannose, galactose, và xylose bị tấn công từ từ vẫn còn. Các hình thức của các kết quả động là khác nhau ở chỗ không có bằng chứng cho sự tồn tại của một vận tốc giới hạn, ngay cả khi nồng độ rất cao của các loại đường (0.5 M) được sử dụng, như đã được thực hiện trong các thí nghiệm dòng chảy dừng lại. Một ví dụ là được đưa ra trong hình dưới. Trong những trường hợp này, kết quả động hoàn toàn quy định bằng cách cho số lượng doanh thu tại bất
kỳ một nồng độ đường.
KO2 có thể không được xác định như là không khả thi làm việc với nồng độ O2 đủ thấp để ảnh hưởng đến giá trị của phản ứng.
Hình 2: Quá trình oxy hóa của xylose bởi glucose oxidase được đo manometrically. Mở điểm, quy mô ở bên trái và phía dưới của hình. Điều kiện: 250, 0.13M đệm phosphate, pH 5.6, 0.1 mg của catalase mỗi bình. Điểm đầy giảm glucose oxidase (1.1 x10-5M) bởi xylose, đo trong một bộ máy dòng chảy dừng lại. Quy mô tại con số bên phải và phía trên của hình. Điều kiện: 250, độ pH 5.6, con đường ánh sáng 2 cm, 450 µm, enzyme và các giải pháp đường kỵ khí.
Hiệu lực chiều dài sóng khác nhau của các quan sát - Một mở rộng của hàng loạt các quyết định đã được thực hiện trong phạm vi 250 đến 470 µm với nhiều nồng độ glucose. Trong mọi trường hợp đã có mối tương quan giữa các kết quả tốt, mặc dù điều chỉnh độ dài sóng ngắn nhất là cần thiết cho hấp thụH2O2 hình thành trong phản ứng.
Quan sát những thay đổi huỳnh quang trong sản lượng- năng suất rõ ràng huỳnh quang của các axit amin thơm của glucose oxidase thay đổi trên quá trình oxy hóa và giảm, và sự thay đổi này đã cũng được sử dụng để thực hiện theo các phản ứng, đặc biệt tại 280 µm và quan sát huỳnh quang thông qua một sự kết hợp của 3 mm Lucite và 1mm của OX73. Những thay đổi trong tương quang huỳnh quang trong lỗi thử nghiệm với những thay đổi trong hấp thụ. Một lời giải thích cho sự thay đổi huỳnh quang thơm axit amin vào quá trình oxy hóa và giảm các men tiêu hóa là một phát thải diễn ra, và được liên kết với một mức độ khác nhau truyền năng lượng. Các mối tương quan giữa độ hấp thụ và thay đổi huỳnh quang hỗ trợ này giải thích và lập luận intramolecular chống lại một sự thay đổi trong cấu hình của protein phân tử.
Một nửa thí nghiệm phản ứng - phản ứng của các enzyme oxy hóa đường được theo sau bằng cách trộn kỹ enzyme deoxygenated với dung dịch đường oxy tự do và quan sát giảm hấp thụ ở 450 µm trong bộ máy dòng chảy dừng lại. Trong mọi trường hợp ngoại trừ 2-deoxyglucose, tỷ lệ xuất hiện của enzyme flavin giảm được tỷ lệ thuận với nồng độ đường được sử dụng với nồng độ cao nhất mà có thể được làm việc trong bộ máy dòng chảy dừng lại. Các giới hạn trên là do sự xuất hiện của thay đổi giả trong hấp thụ do tán xạ trên các gradient chỉ số khúc xạ, và khoảng 0.5 M cho các loại đường như glucose). Với 2-deoxyglucose, có vận tốc tối đa rõ ràng và một cách dễ dàng đo nửa tốc độ tập trung. Các kết quả khác nhau cho đường được thu thập trong bảng 1 trong cột đầu kI và cho thấy rằng, cũng như trong các thí nghiệm sản lượng, glucose phản ứng