II. Một số Enzim oxy hóa –khử ứng dụng trong chế biến thực phẩm
II.2 Các enzyme hoạt hóa oxy (oxydaza)
Các enzyme hoạt hóa oxy phân tử là những enzyme có khả năng chuyển trực tiếp hydro (hoặc electron) cho oxy phân tử cũng như hoạt hóa oxy phân tử làm cho nó có khả năng kết hợp trực tiếp vào cơ chất tạo ra peroxyt hữu cơ.
Các enzyme hoạt hóa oxy tiêu biểu là xitocromoxydaza, polyphenoloxydaza, ascorbatoxydaza, peroxydaza, catalaza, các oxydaza flavin (enzyme flavin hiếu khí).
Nhóm enzyme hoạt hóa oxy bao gồm một số lượng lớn enzyme khác nhau. Tùy thuộc vào bản chất của kim loại có trong thành phần nhóm ngoại của chúng mà các oxydaza cuối có thể chia làm hai nhóm nhỏ:
• Sắt proteit (Fe – proteit)
• Đồng proteit (Cu – proteit).
Fe – proteit
Fe – proteit là những chất xúc tác hai cấu tử có nhóm ngoại là hemin (Fe – pocphirin).
Trong quá trình xúc tác, Fe của enzyme chịu những chuyển hóa oxy hóa khử thuận nghịch.
Hệ xitocrom và catalaza, peroxydaza là những Fe – proteit quan trọng thuộc nhóm này.
Hệ xitocrom
Chỉ có một số nhỏ enzyme flavin ở dạng khử có khả năng chuyển hydro nhận được của mình cho oxy không khí. Nhìn chung, giữa các dehydrogenaza flavin và oxy không khí còn có một hệ enzyme trung gian nữa đó là hệ xitocrom.
Xitocrom – chất màu tế bào – là những pfotit phức tạp có nhóm ngoại là hemin. Cấu tạo của xitocrom c là một trong những xitocrom có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau: Hiện nay, người ta đã biết được trên 20 xitocrom khác nhau. Xitocrom rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có trong động vật, thực vật, nấm men, vi khuẩn hiếu khí và một số vi khuẩn kỵ khí bắt buộc.
Vai trò của các xitocrom trong tế bào sống là chuyển electron cho oxy. Fe của
xitocrom nhận electron từ nguyên tử hydro của dehydrogenaza flavin và chuyển sang dạng khử, khi đó Fe3+ chuyển thành Fe2+ (Fe3+ + e → Fe2+).
Nguyên tử hydro của flavin bị lấy mất electron trở thành ion hydro:
H – e → H+. Dạng khử (chứa Fe2+) của xitocrom chuyển electron nhận được cho dạng
oxy hóa của xitocrom thứ hai đứng sau nó và lại trở về dạng oxy hóa ban đầu, lúc này Fe2+ chuyển thành Fe3+ (Fe2+ - e → Fe3+).
Do có khả năng oxy hóa khử thuận nghịch nên quang phổ hấp thụ của chúng thay đổi và nhờ những nghiên cứu về quang phổ hấp thụ, người ta nhận biết được ba nhóm
xitocrom chính là a, b và c. Keilin tìm ra xitocrom a, b, và c1. Okunuki tìm ra xitocrom
c. Ngày nay, người ta mới chỉ biết chính xác được 5 xitocrom nhóm c, 8 xitocrom nhóm b, và 3 xitocrom nhóm a. Ngoài ra, trong thực vật, nấm men và vi khuẩn người ta còn tìm được xitocrom f.
Trong hệ hô hấp thường có bốn xitocrom: b, c1, c và aa3. các xitocrom trong
chuỗi hô hấp tương ứng với thế oxy hóa khử của chúng. Các xitocrom thường kết gắn trên màng ti thể. Ở vi khuẩn chúng khu trú trên màng vi khuẩn.
Trong quá trình oxy hóa sinh học, electron từ enzyme flavin trung gian chuyển
cho xitocrom b rồi lần lược qua c1, c đến xitocromoxydaza (aa3) là một oxydaza cuối.
Xitocromoxydaza chuyển electron trực tiếp cho oxy phân tử. Oxy kết hợp với electron dưới tác dụng của xitocromoxydaza bị ion hóa và sau đó liên kết với ion hydro tạo thành nước:
½ O2 + 2e → O2-
2H+ + O2- → H2O.
Peroxydaza
Hiện nay, người ta đã biết có ít nhất là bốn peroxydaza:
• Peroxydaza thực vật thượng đẳng
• Peroxydaza mô động vật (vecdoperoxydaza)
• Peroxydaza của sữa (lactoperoxydaza)
• Xitocromoxydaza (có trong nấm men và một số thực vật thượng đẳng).
Peroxydaza là những enxyme hai cấu tử hem và protein. Về phương diện thành phần hóa học và cơ chế tác dụng thi peroxydaza được nghiên cứu kỹ hơn cả. Nhóm ngoại của enzyme này hoàn toàn giống Fe – pocfirin (hemin đỏ) của hemoglobin và catalaza. Fe trong peroxydaza ở dạng hóa trị ba. Theo quan điểm của đa số các nhà nghiên cứu thì hóa trị của Fe trong nhóm ngoại của peroxydaza không thay đổi trong quá trình xúc tác.
Cơ chế tác dụng của peroxydaza có thể khái quát như sau :
AH2 + H2O → A + 2H2O
Trong đó, nó phân hủy hydro peroxyt :
2H2O2 → 2H2O + 2O
giải phóng ra oxy nguyên tử. Sau đó, oxy nguyên tử oxy hóa thành các chất khác nhau.
Các cơ chất có thể bị oxy hóa bởi peroxydaza khi có hydro peroxyt là:
• Hầu hết các phenol ( pirocatechin, pirogalol, acid galic, benzidin,
phenilendiamin, …)
• Các amin thơm
• Các chất dễ oxy hóa (acid ascorbic, nitrit, …).
Theo Bach, peroxydaza có vai trò quan trọng bậc nhất đối với các quá trình oxy hóa xảy ra trong cơ thể. Enzyme này có thể xúc tác sự oxy hóa không những chỉ nhờ hydro peroxyt mà còn nhờ peroxyt hữu cơ khác . Nó có thể sử dụng cả peroxyt của acid béo không no tạo thành dưới tác dụng của lipoxydaza peroxyt của carotenoit.
Polyphenol ở trạng thái tự do cũng như ở các dạng hợp chất phức tạp (glucozit, chất chát, …) và các amin thơm là những cơ chất phổ biến của peroxydaza thực vật.
Ngoài ra, peroxydaza còn có khả năng hoạt động như là oxydaza thực thụ, nghĩa là xúc tác sự oxy hóa cơ chất bằng oxy phân tử khi không có hydro peroxyt.
Các quá trình oxy hóa khử do peroxydaza tiến hành là những mắt xích quan trọng trong chuỗi các quá trình trao đổi chất và năng lượng.
Catalaza
Catalaza cũng như peroxydaza, rất phỏ biến trong động vật (nhiều ở gan, thận, hồng cầu), thực vật, vi sinh vật và một số vi khuẩn yếm khí bắt buộc.
Catalaza cũng là hemoprotit giống như peroxydaza. Catalaza của thực vật chỉ chứa một nhóm hemin trong phân tử. Còn catalaza động vật lại có bốn hemin. Trong quá trình xúc tác Fe của nhóm ngoại không thay đổi hóa trị.
Catalaza xúc tác sự phân hủy hydro peroxyt, giải phóng ra oxy phân tử. Catalaza có hai tác dụng:
- Khi nồng độ H2O2 cao, nó xúc tác phân hủy H2O2 tạo ra oxy phân tử theo cơ chế
sau:
2H2O2 → 2H2O + O2
Trong phản ứng này có hai phân tử H2O2 tham gia một phân tử H2O2 hoạt động như
là chất nhường electron, phân tử kia – chất nhận electron.
- Nếu nồng độ H2O2 thấp (không quá 10-9M), catalaza biểu lộ hoạt tính
peroxydaza. Trong điều kiện sinh học (dư cơ chất, nồng độ H2O2 thấp) catalaza hoạt
động hầu như giống peroxydaza. Keilin và Hartree đã chỉ rõ rằng catalaza có khả năng oxy hóa rượu etylic, metylic cũng như formandehit khi có hydro peroxyt được hình thành dưới tác dụng của các oxydaza flavin (alcoldehydrogenaza, xantioxydaza, oxydaza của các axitamin).
Peroxyt tạo thành trong các phản ứng trao đổi chất ở nồng độ nhất định là chất độc
đối với cơ thể, do vậy phải vai trò của catalaza là ngăn ngừa sự tích tụ H2O2.
Cu – proteit
Cu – proteit là những enzyme là những oxydaza cuối rất quan trọng, có chứa nguyên tử đồng trong nhóm ngoại. Các chất tiêu biểu của nhóm enzyme này là polyphenoloxydaza, ascorbatoxydaza.
Polyphenoloxydaza
Polyphenoloxydaza (còn gọi là phenolaza hay phenoloxydaza) xúc tác sự õ hóa các polyphenol khác nhau các dẫn xuất của chúng, cũng như một loạt các monophenol tạo thành các kinon tương ứng khi có oxy phân tử. Chúng khá phổ biến trong thực vật thượng đẳng và vi khuẩn. Polyphenoloxydaza không có tính đặc hiệu cơ chất cao.
Đa số các nhà nghiên cứu cho rằng cơ sở tác dụng của các polyphenoloxydaza là sự
oxy hóa thuận nghịch nguyên tử đồng hóa trị một (Cu+) thành đồng hóa trị hai (Cu2+). Có
một số người cho rằng ion đồng liên kết bền vững với protein của enzyme và không thay đổi hóa trị khi phản ứng. Theo quan điểm thứ nhất, phản ứng oxy hóa pirocatechin (một ví dụ điển hình về sự xúc tác của polyphenoloxydaza):
2Cu+ + 2H+ + ½O2 → 2Cu2+ + H2O
Trong điều kiện hô hấp bình thường, các kinon xuất hiện khi oxy hóa polyphenol
lập tức bị khử ngay bởi NAD.H2 và NADP.H2 (các chất này thường bị oxy hóa trong
chuỗi hô hấp), rồi lại bị oxy hóa cho hydro, sau đó lại bị khử, … và từ đây mở ra những đường hướng oxy hóa phụ:
Cở chất → dehydrogenaza piridin → octokinon → Cu – proteit
(polyphenoloxydaza) → O2
Polyphenoloxydaza và polyphenol có trong quả và lá cây, nên khi rau quả bị dập, nát, cắt, thái, … thì sự phối hợp giữa các giai đoạn oxy hóa và khử của sự hô hấp bị phá vỡ, do đó các octokinon được tạo nên khi oxy hoá polyphenol có thể trùng hợp với các chất không có bản chất phenol như axitamin, các amin để hình thành các sản phẩm có màu. Đây là nguyên nhân của hiện tượng thâm đen thường thấy khi cắt táo, khoai tây, khi vò lá chè, thuốc lá, … Hoạt lực xúc tác của polyphenoloxydaza trong các đối tượng này rất cao.
Trong nhóm polyphenoloxydaza có những enzyme oxy hóa các monophenol goi là monophenoloxydaza. Tirozinaza là chất điển hình, nó xúc tác sự oxy axitamin tirozin tạo ra kinon tương ứng (tirozinaza có trong vi khuẩn, nấm men, bột mì và trong động vật).
Sau một loạt chuyển hóa các kinon này cho ra chất xám màu đen gọi là melanin. Đây là nguyên nhân bị thâm đen của bột mì khi bảo quản không tốt.
Polyphenoloxydaza đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của cơ thể thực vật. Nhiều tác cho rằng polyphenoloxydaza hoàn thành chức năng của oxydaza cuối, cùng với xitocromoxydaza và ascorbatoxydaza.
Ascorbatoxydaza
Ascorbatoxydaza có chứa trong hầu hết các mô xanh của thực vật và trong tảo nâu, tảo hồng ; có nhiều trong cải bắp, súplơ, bầu bí, dưa chuột, chuối, táo, cà rốt, đào, lê, …
Enzyme này là một protein có chứa đồng (0,24%), xúc tác oxy hóa acid ascorbic (vitamin C). Enzyme này rất quan trọng trong kỹ nghệ thực phẩm, vì nó có quan hệ mật thiết với phẩm chất của sản phẩm.
Axid ascorbic có thể bị oxy hóa trực tiếp dưới tác dụng của ascorbatoxydaza đặc hiệu hay xitocromoxydaza và gián tiếp qua các kinon hoặc các sản phẩm oxy hóa tạo thành các oxydaza khác. Điều này cho phép :
- Mở rộng các đường hướng oxy hóa phụ
- Liên hợp sự hô hấp với các đường hướng oxy hóa phụ mà dehydroascorbat là chất nhận hydro của cơ chất, sau đó ascorbat tạo thành sẽ bị oxy hóa bởi
xitocromoxydaza.
Oxygenaza
Trong những năm gần đây, ngoài các oxydaza “cổ điển” sử dụng oxy phân tử làm chất nhận electron ra, người ta còn tìm thấy các enzyme hoạt hóa oxy phân tử làm cho nó có khả năng kết hợp trực tiếp vào cơ chất để tạo ra peroxit hữu cơ. Hayaishi goi chúng là “oxygenaza”, còn Mason đề nghị gọi là “transferaza oxy”. Nhóm enzyme này gồm có : pirocatechinaza, tryptophanoxygenaza, lipoxidaza …
Pirocatechinaza xúc tác sự phân hủy oxy hóa vòng thơm của catechin tạo ra peroxyt vòng.
Tryptophanoxygenaza xúc tác oxy hóa trực tiếp tryptophan thành formylkinurenin. Trong nhóm này, lipoxydaxa là enzyme quan trọng hơn cả.
Lipoxydaza
Lipoxydaza xúc tác sự oxy hóa chất béo có chứa acid béo không no (có 2 – 3 liên kết kép trở lên) thành peroxyt và hydro peroxyt. Các acid béo không no là hợp phân của lipit tế bào rất phổ biến trong thế giới thực vật. Vì vậy, lipoxydaza là cấu tử quan trọng của hệ hô hấp. Lipoxydaza rất phổ biến trong thực vật (trong cây họ đậu, khoai tây, cà rốt, …).
Nó là một globulin có 881 gốc acidamin. Chưa rõ bản chất của nhóm ngoại, chỉ biết là nó không chứa kim loại và nhóm –SH.
Lipoxydaza chỉ xúc tác oxy hóa các acid linoleic, linolenic và arachidic, đồng thời chỉ tác dụng lên dạng cis mà không tác dụng lên dạng trans. Sản phẩm hình thành là hydro peroxyt, sau khi bị phân hủy hydro peroxyt cho epoxyt, aldehit, xeton, rượu bậc
cao và các sản phẩm oxy hóa khác. Cơ chế tác dụng của lipoxydaza đến nay vẫn chưa rõ hoàn toàn. Một số tác giả cho rằng sự oxy hóa chất béo xúc tác bằng enzyme này cũng tương tự như sự tự oxy hóa theo cơ cấu phản ứng mạch. Trong trường hợp này,
lipoxydaza phản ứng với oxy phân tử tạo ra peroxyt và chuyển oxy hoạt động sang phân tử acid béo. Lipoxydaza chỉ làm chức năng của chất mào đầu phản ứng mạch có khả
năng lấy hydro từ nhóm metylen -CH2- của acid linoleic. Sau đó, phản ứng tiếp diễn theo
cơ cấu phản ứng mạch không có sự tham gia của enzyme. Hiện nay, giả thuyết này được ít người ủng hộ.
Theo Tappel và Bower, mỗi một phân tử linoleat đều bị oxy hóa trực tiếp dưới tác dụng của lipoxydaza. Sự oxy hóa bắt đầu bằng việc tạo thành phức chất enzyme – cơ chất – oxy. Sau đó, hình thành gốc đôi do hydro được chuyển từ linoleat đến oxy. Gốc đôi tạo ra hệ liên hợp và sau cùng bị phân giải cho hydro peroxyt và lipoxydaza tự do.
Hydro peroxyt của cơ chất được tạo thành có khả năng oxy hóa rất lớn. Với sự tham gia của chúng, trong tế bào các phenol bị oxy hóa ra kinon. Kinon lại tham dự vào sự oxy thứ cấp sản phẩm phân hủy của protein, gluxit, acid ascorbic và các hợp chất khác. Như thế là qua hệ polyphenol-kinon, lipoxydaza liên hợp với toàn nhóm enzyme oxy hóa – khử trong tế bào sống.
Hydro peroxyt có thể oxy hóa những phần mới của acid béo chưa no, cũng như các carotenoit, clorofil, acidamin, acid ascorbic, … Vì thế, lipoxydaza có ý nghĩa rất lớn đối với kỹ nghệ sản xuất, bảo quản lương thực, thực phẩm. Nó là một tác nhân gây nên quá trình ôi của các sản phẩm như bột, các loại gạo xay khác.
Các oxydaza flavin (dehydrogenaza hiếu khí)
Ngoài các enzyme flavin đã nói ở phần dehyrogenaza yếm khí, còn có các enzyme flavin làm chức phận các oxydaza cuối. Nhóm enzyme flavinoxydaza này xúc tác sự chuyển trực tiếp hydro (hoặc electron) của cơ chất cho oxy phân tử. Về đặc điểm phản ứng do chúng xúc tác, các dehydrogenaza hiếu khí rất gần với oxydaza. Trong nhóm enzyme này coa glucooxydaza, oxydaza của các acidamin và amin, xantioxydaza, oxydaza của acid glicolic, …
Nhóm ngoại của đa số oxydaza flavin là FAD chỉ một số nhỏ enzyme này có nhóm ngoại là FMN.
Nhiều enzyme flavin có chứa trong thành phần nhóm ngoại ion kim loại như sắt, đồng, molipden, … xuất phát từ quan niệm hiện đại, tất cả enzyme flavin có thể chia ra làm hai nhóm :
- Flavoprotein chứa kim loại
- Flavoprotein không chứa kim loại.
Trong các enzyme flavin chứa kim loại thì xantinoxydaza có chứa molipden, nitratreductaza cũng chứa molipden ; dehydrogenaza của butyryl – CoA là Cu – flavoprotein ; NAD.H – xitocrom c – reductaza có sắt trong thành phần.
Xantinoxydaza đóng vai trò quan trọng trong trao đổi purin ở cơ thể động, thực vật. Nó xúc tác sự oxy hóa hipoxantin thành xantin và xantin thành acid uric.
Trong nhóm các flavinprotein không chứa kim loại thì oxydaza của các acidamin cũng như glucooxydaza là quan trọng hơn cả.
Oxydaza của acidamin xúc tác phản ứng oxy hóa acidamin tạo ra xetoaxit hoặc
aldehitaxit, NH3 và hydro peroxyt.
Glucooxydaza oxy hóa trực tiếp phân tử glucoza không phosphoryl hóa. Nhóm ngoại của enzyme này là FAD. Nó rất phổ biến trong nấm mốc và có trong mô thực vật.
C6H12O6 + H2O + ½O2 → C6H12O7 + H2O2
Đáng chú ý là oxy của hydro peroxyt tạo thành dưới tác dụng của các
dehydrogenaza hiếu khí được peroxydaza sử dụng để oxy hóa các chất khác. Do đó, các dehydrogenaza flavin hiếu khí tạo nên hệ liên hợp với peroxydaza.
Một số oxydaza flavin có khả năng chuyển hydro (hoặc electron) không những cho oxy mà còn cho một số chất tiếp nhận khác (nitrat, kinon, …), nên các oxydaza flavin cũng như các dehydrogenaza flavin có thể xem như là các chất chuyển hydro trung gian.
Trên cơ sở những điều đã trình bày về enzyme oxy hóa – khử (dehydrogenaza, oxydaza, các chất chuyển trung gian) có thể hiểu một cách khái quát sự tham gia của chúng vào quá trình chuyển vận electron tức là quá trình oxy hóa sinh học cơ bản (hô hấp) trong tế bào sống như sau (để cho tiện ta lấy ví dụ về các quá trình oxy hóa – khử trong tế bào thự vật :
Đồng thời ta có thể rút ra một số đặc điểm lớn của nhóm enzyme này.
Đặc điểm thứ nhất của các oxydoreductaza trong tế bào sống là chúng tạo thành chuỗi hô hấp (chuỗi các enzyme oxy hóa – khử) để thực hiện việc chuyển vận đa bậc nguyên tử hydro hoặc điện tử từ cơ chất sơ cấp đến chất nhận cuối cùng là oxy.
Đặc điểm thứ hai của chúng là khả năng xúc tác một số phản ứng oxy hóa – khử khác nhau mặc dù lượng coenzyme không nhiều lắm, nhưng do một coenzyme có thể gắn kết nhiều apofemen hay apoenzyme.
Đặc điểm thứ ba – đặc điểm chính của nhóm enzyme này là chúng xúc tác các quá