ADN tổng số của các mẫu Song mật thu được sau khi tách chiết dùng
làm khuôn cho các phản ứng PCR với 20 đoạn mồi RAPD có tên và trình tự
tại bảng 2.2.
Phản ứng PCR – RAPD được tiến hành gồm các thành phần: ADN
khuôn, mồi đơn, Taq polymerase, 4 loại deoxynucleotit triphotphat (dNTPs)
và dung dịch đệm, muối MgCl2. Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR được
tiến hành trên khuôn là các ADN của các mẫu Song mật thu được ở trên với 20 mồi RAPD để tiến hành phân tích sự biến đổi di truyền của các dòng Song mật.
Sau khi hoàn thành phản ứng PCR sản phNm được điện di trên gel
agarose 1,2% để phân tích đa hình ADN của các mẫu nghiên cứu. Các phân đoạn RAPD thu được được phân tích dựa trên sự có mặt hay không có mặt
của chúng ở các mẫu nghiên cứu. Nếu có thì ký hiệu 1 còn không thì có ký
hiệu là 0. Những phân đoạn mà có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu khác gọi là phân đoạn đa hình. Dựa vào mức độ đa hình của các phân đoạn này chúng ta có thể đánh giá mức độ khác nhau và giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu.
Kết quả của phản ứng PCR – RAPD quan sát được sau khi nhuộm bản gel bằng EtBr và soi dưới tia UV. Bằng phần mềm quan sát và chụp ảnh kết quả để thuận tiên hơn trong việc phân tích số liệu. Với 15 mẫu phân tích và 20 đoạn mồi RAPD ta có 300 phản ứng, trong đó có 3 đoạn mồi không xuất hiện phân đoạn ADN nào khi soi bản gel (PC04; PC07; PC15).
Các phân đoạn ADN được nhân lên là những băng vạch sáng màu xuất hiện trên bản gel hình 3.2.
29
Hình 3.2. Sản ph-m PCR – RAPD với mồi PC 09; M: Marker 1Kb; S1 – S15: các mẫu Song mật (theo Bảng 2.1).
Kết quả của phản ứng PCR – RAPD với mồi PC09 cho kết quả rất tốt, các băng vạch rõ nét mặc dù lượng ADN được nhân lên là không nhiều. Sản phNm ADN nhân lên với mồi PC09 cho kích thước nhỏ, tập trung khoảng 0,4 – 1,4kb. Tại vị trí marker 1,4 kb chỉ có 6 mẫu S1, S2, S3, S4, S5 và S6 xuất xứ từ Hòa Bình có sự xuất hiện các phân đoạn ADN; các mẫu còn lại không xuất hiện phân đoạn ADN ở vị trí này, đây là phân đoạn đa hình đầu tiên của mồi PC09 (theo thứ tự từ trên xuống).
Theo quy ước băng vạch sáng (xuất hiện) sau khi điện di ở mẫu này mà không xuất hiện ở mẫu khác thì băng vạch đó là được xem là băng đa hình và chỉ vị trí nào xuất hiện băng vạch mới được kí hiệu là 1, còn không xuất hiện băng vạch kí hiệu là 0 (mã hóa số liệu theo bảng nhị phân). Sau khi nhận được kết quả là hình ảnh điện di sản phNm PCR – RAPD của mồi PC09, tiến hành mã hóa kết quả trước khi đưa vào phân tích số liệu bằng việc so hàng
2,0 kb
1,6 kb
1,0 kb
ngang, mẫu nào có băng vạch thì đánh số 1 và mẫu nào không có băng vạch đánh số 0. Tiến hành làm cho đến vạch cuối cùng của bản gel. Mồi PC09 có tổng cộng 7 phân đoạn ADN xuất hiện với các kích thước khác nhau, trong đó có xuất hiện 1 phân đoạn là đơn hình tại vị trí marker 0,6 kb; còn lại 6 phân đoạn là đa hình chiếm 85,7% tổng số phân đoạn ADN.
Sử dụng đoạn mồi PC09 phân tích với 15 mẫu Song mật cho tổng số băng ADN xuất hiện là 61 với 46 băng đa hình còn lại 15 băng đơn hình. Vậy số băng đa hình chiếm 75,4% tổng số băng xuất hiện.
Với những phân tích trên ta có:
Bảng 3.2. Bảng số liệu mã hóa các băng vạch ADN của mồi PC 09
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0