3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
1.4.3. Ứng dụng của chỉ thị SSR trong nghiên cứu đa đạng di truyền, chọn tạo
tạo các giống lúa thơm
Trên thực tế, việc chọn giống lúa chất lượng dựa trên kiểu hình rất khó do có sự tương tác giữa các gen. Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen quy định mùi thơm, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn.
Xác định gen thơm bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen thơm và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen thơm trong quần thể phân li. Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen thơm khác nhau được chọn lọc là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình.
Tác giả Sujatha (2004) nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các giống lúa Basmati bằng chỉ thị SSR. Nghiên cứu được tiến hành trên 30 giống lúa thơm (bao gồm 22 giống lúa Basmati hạt ngắn và 8 giống Basmati hạt dài) dựa trên 6 chỉ thị SSR. Kết quả cho thấy 20 trong số 22 giống lúa thơm hạt ngắn nằm cùng một nhóm lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn còn lại nằm cùng nhau và tách riêng so với các nhóm khác, tám giống lúa Basmati hạt ngắn nằm trong cùng một nhóm khác. Tác giả đã khẳng định chỉ thị phân tử cung cấp ước lượng đa dạng di truyền chính xác so với các chỉ thị hình thái. Kết quả nghiên cứu này cũng giúp cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thích hợp trong công tác lai tạo giống lúa chất lượng (Sujatha, 2004) [34].
Tác giả Shu Xia Sun và cộng sự (2008) tiến hành kiểm tra gen thơm và không thơm trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi. Kết quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi Aro7 được xác định 302 bp. Ngoài ra, cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus hương thơm với khoảng cách là 0,71 cM. Các gen thơm (fgr) được thể hiện giữa marker Aro7 (0,57 cM) và RM515 (0,71 cM). Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (Bacterial Artificial Chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 1.1) [35].
Hình 1.1: Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8
Tác giả K. Kibria và cộng sự (2009), phân tích đa dạng di truyền gen thơm của lúa bằng chỉ thị SSR và RAPD. Công trình nghiên cứu được thực hiện từ tháng 7 năm 2006 đến tháng 4 năm 2008 tại Viện hạt nhân Nông nghiệp (Bina), Mymensingh, Bangladesh. Kết quả chạy SSR của ba mồi (RM223, RM342A và RM515) thu được kết quả 46 băng, mức trung bình của allele dao động từ 1,78 đến 2,49 [25].
Tác giả Malik Ashiq Rabbani và cộng sự (2010), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền giữa các giống lúa truyền thống và giống lúa đã được cải tiến ở Pakistan. Nghiên cứu được thực hiện trên hai giống lúa Basmati thơm và không thơm thuộc nhóm lúa Indica. Tổng số 41 dòng được đưa vào đánh giá bởi 30 marker SSR được phân bố trên khắp bộ gen của lúa. Kết quả phân tích thu được tổng số 104 allele và tất cả đều đa hình, hệ số allele dao động 2 - 6 allele, trung bình là 3,5 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,259 - 0,782 (trung bình là 0,571). Sau khi số liệu được phân tích bằng phần mềm UPGMA, 41 giống lúa đã được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm I gồm có 22 giống (15 giống lúa thơm Basmati và 5 giống không thơm, hai giống lúa
Japonica). Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm. Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa Basmati không thơm. Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả người nông dân và người tiêu dùng [28].
Tác giả Olufowote và cộng sự (1997) đã nghiên cứu biến động di truyền trong giống của 71 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP. Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến. Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng các allele ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến. Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các allele cao hơn chỉ thị AFLP. Các tác giả cũng chỉ ra rằng chỉ cần chọn chính xác 4 chỉ thị SSR là có thể nghiên cứu các allele dị hợp tử ở lúa [32].
Tác giả Natalya (2000) đã sử dụng chỉ thị RFLP đánh giá đa dạng di truyền của 342 giống lúa Việt Nam và nhận thấy rằng các giống lúa được thu thập từ miền Nam Việt Nam thuộc nhóm Indica và các giống lúa thu từ miền Bắc thì phần lớn thuộc nhóm Japonica. Sau nghiên cứu tác giả đã đưa ra kết luận Việt Nam là một nước có đa dạng di truyền lúa thuộc loại cao nhất thế giới [20].
Tác giả Mahmoud (2005) tiến hành nghiên cứu biến động và quan hệ di truyền của 7 giống lúa bằng việc kết hợp của 8 mồi RAPD, 6 mồi SSR và 8 mồi AFLP. Kết quả thu được cho thấy mức độ đa hình tương ứng với chỉ thị RAPD, SSR và AFLP là 72,2%, 90% và 67,9% . Cũng qua kết quả này, tác giả khẳng định rằng các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa (Mahmoud M. Saker và ctv., 2005) [27].
Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 38 giống lúa thơm bản địa Basmati bằng chỉ thị SSR của tác giả Raj (Raj và ctv., 2006). Tác giả đã sử dụng 32 cặp mồi, kết quả nghiên cứu cho thấy, có 26 cặp mồi đa hình (81,25%), hệ số PIC dao động từ 0,00 (RM259 và RM230) đến 0,83 (RM420).
Theo Singh Balwant và cộng sự (2011), nghiên cứu đa dạng di truyền của 50 giống lúa thơm bằng chỉ thị SSR, hình thái, đánh dấu hóa lý. Kết quả SSR marker phân tích cho thấy đa hình khác biệt giữa các giống với 28 mồi và hệ số PIC có giá trị dao động từ 0,139 - 0,99 với trung bình 0,589 cho mỗi mồi [35].
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
Vật liệu sử dụng nghiên cứu bao gồm 17 giống lúa chất lượng được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, đang được lưu giữ và bảo tồn tại Ngân hàng gen hạt của Trung tâm Tài Nguyên Thực vật (Bảng 2.6).
15 cặp mồi SSR được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau (Bảng 2.7).
Bảng 2.6: Danh sách 17 giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu
TT SĐK Tên giống Nguồn gốc Kí hiệu
1 233 Tám tức Tây Bắc Tây Bắc T1
2 259 Tám trắng Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc T2
3 268 Tám đen Hà Đông Hà Nội T3
4 287 Tám thơm Hải Dương Hải Dương T4
5 290 Tám thơm Thái Bình Thái Bình T5
6 305 Tám tròn Hải Dương Hải Dương T6
7 307 Tám đứng Hải Dương Hải Dương T7
8 313 Tám xoăn có râu Hải Dương Hải Dương T8
9 314 Tám xoan Bắc Ninh Bắc Ninh T9
10 316 Tám nghệ hạt đỏ - T10
11 317 Tám xoan Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc T11
12 1048 Tám xoan Hải Hậu Nam Định T12
13 2375 Tám thơm ấp bẹ Nam Định
Ninh Bình T13
14 5117 Tám Xuân Đài Nam Định T14
15 5118 Tám tiêu - T15
16 5119 Tám Xuân Hồng - T16
17 5120 Tám Nghĩa Hồng Nam Định T17
Bảng 2.7: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu
TT Tên mồi Trình tự mồi NST Kích thước
(bp) 1 RM 13 3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG-5’ 5’-GGTGGCATTCGATTCCAG-3’ 5 124-154 2 RM 30 3’-GGTTAGGCATCGTCACGG-5’ 5’-TCACCTCACCACACGACACG-3’ 6 171-183 3 RM 282 3’-CTGTGTCGAAAGGCTGCAC-5’ 5’ –CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG-3’ 3 128-151 4 RM 135 3’-CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG-5’ 5’-TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCTC-3’ 3 119-131 5 RM 142 3’-CTCGCTATCGCCATCGCCATCG-5’ 5’-TCGAGCCATCGCTGGATGGAGG-3’ 4 235-238 6 RM 143 3’-GTCCCGAACCCTAGCCCGAGGG-5’ 5’-AGAGGCCCTCCACATGGCGACC-3’ 3 195-207 7 RM 270 3’-GGCCGTTGGTTCTAAAATC-5’ 5’-TGCGCAGTATCATCGGCGAG-3’ 12 104-117 8 RM 153 3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’ 5’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-3’ 5 196-234 9 RM 162 3’ –CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG-5’ 5’ - GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG-3’ 6 201-238 10 RM 171 3’-AACGCGAGGACACGTACTTAC-5’ 5’-ACGAGATACGTACGCCTTTG-3’ 10 310-356 11 RM 172 3’-TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG-5’ 5’-CAACCACGACACCGCCGTGTTG-3’ 7 159-165 12 RM 174 3’-AGCGACGCCAAGACAAGTCGGG-5’ 5’-TCCACGTCGATCGACACGACGG-3’ 2 207-222 13 RM 224 3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’ 5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’ 11 120-152 14 RM 245 3’-ATGCCGCCAGTGAATAGC-5’ 5’-CTGAGAATCCAATTATCTGGGG-3’ 9 136-146 15 RM 515 3’-TAGGACGACCAAAGGGTGAG-5’ 5’-TGGCCTGCTCTCTCTCTCTC-3’ 8 205-231
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Mẫu lá của từng dòng được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến.
• Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C.
• Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn.
• Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800µl CTAB buffer và 60 µl SDS 10%.
• Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
• Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới.
• Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1). Thu được dịch chiết chứa ADN.
• Tủa ADN bằng ethanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ.
• Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
• Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE.
• Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% .
Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể như sau:
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất hai lần khử ion 3,2
2 Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM 1
3 dNTPs 10mM 1,0
4 Taq ADN polymerase 1U/µl 0,8
5 Mồi xuôi 5µM 1,5 6 Mồi ngược 5µM 1,5 7 ADN 10g/µl 1 Tổng thể tích của một phản ứng 10,0 * Chương trình PCR: Các bước Nhiệt độ (oC)
Thời gian Số chu kỳ
I 94 5 phút 1 II 94 1 phút 35 56 45 giây 72 1 phút III 72 7 phút 1 Giữ mẫu ở 40C 2.2.3. Điện di sản phẩm PCR
+ Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích
thước 30cm x 12cm):
• Nước cất khử ion: 22,2ml
• Dung dịch acrylamide 40%: 6ml
• Dung dịch APS 10%: 300µl
• Dung dịch TEMED: 25µl
• Tổng thể tích gel: 30ml
Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính.
+ Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker X174 ở điều kiện 150V.
Thời gian điện di khoảng 50-60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.
2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu
Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng lúa, các kết quả thu được từ quá trình điện di sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN.
• Số 1: các allele có xuất hiện băng ADN
• Số 0: các allele không xuất hiện băng ADN
• Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các allele (mất số liệu) Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi.
- Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: PIC =1 - ΣPi2
Trong đó: Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i
Sau đó, số liệu được chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 để phân tích, tìm ra hệ số tương đồng di truyền (Jaccard) và thành lập cây quan hệ phát sinh.
- Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi giống lúa được tính theo công thức: Y M X H − = %
Trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện nhiều hơn 1 băng ADN/1 locus SSR. Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN.
M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu.
- Tính tỷ lệ số mồi không xuất hiện băng ADN (M%) bằng công thức:
M Z M% =
Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng AND. M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến để tách chiết ADN hệ gen từ lá của các giống lúa nghiên
cứu. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất tẩy Cetyl- Trimethyl- Amonium- Bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan hơn nhiều so với các chất khác. Vì vậy, CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic.
ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy các băng ADN tổng số của các giống lúa Tám thơm thu được gọn, sáng đồng đều, không đứt gẫy hay lẫn tạp. Nồng độ ADN cao, đủ tiêu chuẩn để thực hiện các phản ứng PCR và cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.2: ADN tổng số của 17 giống lúa nghiên cứu.
3.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi
Bảng 3.8. Tần số allele trên từng cặp mồi TM KT (bp) Tên mẫu allele f f2 1-sumf2 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 RM13 155 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0.118 0.014 135 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0.118 0.014 120 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 13 0.765 0.585 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.612 0.39 RM30 130 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 13 0.765 0.585 125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 4 0.235 0.055 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.640 0.36 RM282 110 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0.375 0.141 105 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 1 0 0 0 1.5 0.094 0.009 95 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0.188 0.035 85 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 1 0 1 1 1 5.5 0.344 0.118 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 16 0.303 0.70 RM135 135 0 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0.029 0.001 125 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 4 0.235 0.055 120 0 0.5 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 12.5 0.735 0.541 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.597 0.40 RM142 235 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 1.000 1.000 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0 RM143 275 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.063 0.004 250 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 12 0.750 0.563 235 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0.188 0.035
∑ 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 0.602 0.40 RM270 120 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 7 0.412 0.170 105 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 10 0.588 0.346 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.516 0.48 RM153 225 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.059 0.003 210 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0.235 0.055 200 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0.5 0 3.5 0.206 0.042 190 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0.5 1 6.5 0.382 0.146 180 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0.118 0.014 ∑ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 0.261 0.74