Thực hiện trong điều kiện vô trùng, trong Clean bench
1. Chuẩn bị cho pha loãng mẫu và mẫu chuẩn bậc 5 và 10: xếp týp pha loãng ra giá cắm týp, căn cứ vào số lượng mẫu và số nồng độ pha loãng xếp đủ theo thứ tự. Hút 1,8ml GM5%BS cho týp pha loãng bậc 10 (1 lg) và hút 1,1ml GM5%BS cho týp pha loãng bậc 5 (0,5 lg )
2. Lấy các khay tế bào (phiến 6 giếng) từ tủ 370C, 5%CO2 ra, soi trên kính hiển vi để quan sát tế bào, kiểm tra tình trạng tế bào. Tế bào kín đều 1 lớp đủ điều kiện cho thử nghiệm.
3. Loại bỏ nước nổi nuôi tế bào trong phiến (sử dụng chai nhựa 5L và phễu inox để thực hiện thao tác này) trải khăn không sinh bụi thấm cồn lên bàn. Úp ngược phiến lên khăn không sinh bụi thấm cồn đã chuẩn bị sẵn để thấm hết môi trường còn sót lại trong giếng tế bào.
4. Dán nhãn về phía bên phải phiến với thông tin: tên mẫu, số phiến
5. Hồi chỉnh vacxin: 0,7 ml (đối với mẫu chuẩn M16-6) và 5,5 ml (đối với vacxin mẫu do Polyvac sản xuất)
6. Pha loãng bậc 10: cho 0,2ml mẫu vào týp có sẵn 1,8ml GM5% BS → trộn đều, (mẫu đã được pha loãng ở nồng độ 10-1 ở týp này). Pha loãng nồng độ tiếp theo, thêm 0,2ml mẫu ở nồng độ 10-1 vào týp chứa 1,8ml môi trường ở týp kế tiếp → trộn đều, được mẫu pha loãng 10-2 tiếp tục làm như vậy đến khi hết nồng độ pha loãng
7. Pha loãng bậc 5: cho 0,5 ml mẫu pha loãng 10-1 sang týp chứa 1,1ml GM5%BS → trộn đều, mẫu được pha loãng 10-1,5. Pha loãng 10-2,5 cũng thực hiện như vậy từ týp pha loãng 10-2 tiếp tục làm như vậy đến khi hết nồng độ pha loãng
Ví dụ : Quy trình pha loãng như sau:
Bậc pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 Mẫu 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml GM5%BS 1,8 ml 1,8 ml 1,8 ml 1,8 ml Bậc pha loãng 10-1,5 10-2,5 10-3,5 Mẫu 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml GM5%BS 1,1 ml 1,1 ml 1,1 ml
10-3 10-3,5 10-4
9. Lặp lại bước (6) và (7) với các mẫu và mẫu chuẩn còn lại cho đến hết
10. Sau gây nhiễm láng phiến sang trái, phải để lượng mẫu gây nhiễm phủ kín bề mặt tế bào, xếp phiến vào khay hấp phụ ở điều kiện 37 ± 10C, 5%CO2 trong 60 phút
11. Kết thúc thời gian hấp phụ lấy khay tế bào đặt vào Clean bench, lấy MEM 2 lần và Agarose 1% chuẩn bị sẵn từ bể điều nhiệt ra, dùng khăn không sinh bụi thấm cồn lau sạch bên ngoài 2 chai và chuyển vào Clean bench, lau lại một lần nữa trong clean bench. Đổ chai MEM 2 lần vào chai Agarose (tỷ lệ 1:1) lắc đều, dùng pipet thuỷ tinh 10ml vô trùng để phủ thạch, phủ 3ml/giếng. Phủ xong phiến nào phải lắc nhẹ phiến cho đều môi trường gây nhiễm và môi trường phủ thạch hoà đều vào nhau.
12. Để nguyên số phiến vừa phủ thạch tại chỗ cho đến khi đông hoàn toàn (20 ~ 30 phút) nuôi ở điều kiện 37 ± 10C, 5%CO2 trong 7 ngày
13. Sau 7 ngày nuôi cấy ở điều kiện 37 ± 10C, 5%CO2 tiến hành phủ thạch lần 2 có đỏ trung tính, thành phần của phủ thạch lần 2 như mô tả ở 2.1.1.5
14. Tiếp tục nuôi ở 37 ± 10C, 5%CO2 trong vòng 3 ~ 4 ngày
15. Đếm PFU (mầu trắng trên nền mầu đỏ)
16. Tính kết quả