KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Thí nghiệm in vitro
4.1.1.Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới khả năng tạo mẫu sạch
tới khả năng tạo mẫu sạch
Tạo nguồn vật liệu ban đầu cho công tác nhân giống, công việc đầu tiên là khử trùng mẫu. Đối với các loại cây trồng khác nhau, việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có ý nghĩa quyết định tới sự thành công của cả quá trình nghiên cứu tạo cây con giống.
Giai đoạn này cây cần đạt các yêu cầu sau: - Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp
- Tỷ lệ mẫu sống cao
- Mô nuôi cấy sinh trưởng tốt.
Các mẫu trước khi được đưa vào nuôi cấy in vitro có thể được khử trùng bằng các biện pháp khác nhau. Phương pháp khử trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn là: Canxihyclorit (Ca(OCl)2), thủy ngân Clorua (HgCl2) hoặc Hyđroxit (H2O2) để khử trùng. Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian sử lý, khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ, ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy và khả năng đẩy hết các bọt khí trên bề mặt mô cấy ra ngoài (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Với cây tỏi sau khi nghiên cứu các tài liệu chúng tôi thấy dùng HgCl2 0,1% là cho tỷ lệ mẫu sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Vì vậy chúng
tôi tiến hành thí nghiệm khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút, 6 phút, 10 phút với mục đích tìm ra thời gian khử trùng tốt nhất.
Các thao tác thực hiện :
+ Củ tỏi được bóc ra từng múi, bóc hết lớp vỏ lụa bên ngoài, cắt hết phần đầu và phần bên cạnh chỉ lấy phần chứa đỉnh sinh trưởng kích thước khoảng 1cm3 đem rửa bằng nước sạch, sau đó đem ngâm trong nước xà phòng 2 phút rồi rửa sạch xà phòng bằng nước sạch tráng lại bằng nước cất rồi đem khử trùng tại buồng cấy vô trùng. Mẫu cấy được đặt trong bình kín vô trùng tráng qua 2 lần bằng nước cất vô trùng, đổ cồn vào bình đựng mẫu lắc nhẹ trong 30 giây. Đổ hết cồn và tráng lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Chia mẫu ra 3 bình đã được khử trùng rồi đổ dung dịch HgCl2 0.1% đủ ngập lắc nhẹ để trong 4phút, 6phút, 10 phút. Sau đó lấy mẫu ra tráng lại bằng nước cất vô trùng 4- 5 lần để cho khô trước khi tiến hành thí nghiệm. Sau khi mẫu đã được khử trùng tiến hành cắt Meristem trên kính hiển vi và nuôi cấy ở môi trường Ms + 30g/l đường. Sau 2 tuần nuôi cấy thu được ở bảng1.
Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch
CT Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống sạch (%) CT1 : Khử trùng bằng HgCl2 trong 4 phút 37.52 16.66 45.82 CT2 : Khử trùng bằng HgCl2 trong 6 phút 19.44 11.20 69.44 CT3 : Khử trùng bằng HgCl2 13.85 34.80 51.35
Hình 1: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch.
Từ bảng 1 và hình 1 chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
Sau hai tuần nuôi cấy tỷ lệ mẫu sống sạch, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu chết từ các công thức khác nhau rõ rệt.
Khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút (CT1) thì cho tỷ lệ mẫu sạch không cao chỉ chiếm 45,75%, tỷ lệ nhiễm khá cao chiếm 37,5%, tỷ lệ mẫu chết chiếm 16,66%.
- Khi khử trùng HgCl2 0,1% trong 6 phút thì tỷ lệ mẫu sạch tăng lên khá cao 69,44% tăng lên 1,5 lần so với khử trùng HgCl2 trong 4
bằng HgCl2 trong 4 phút. Tỷ lệ mẫu chết cũng giảm đáng kể chỉ còn 11,12%.
- Khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút thì cho tỷ lệ mẫu sống sạch giảm xuống còn 51,35%, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn mẫu sống sạch giảm xuống còn 51,35%, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn công thức 2 chỉ chiếm 13,85%. Trong khi tỷ lệ mẫu chết tăng lên rất cao 34,8% gấp 3 lần công thức2 và gấp 2 lần công thức 1. Nguyên nhân khiến cho tỷ lệ mẫu chết tăng lên là do thời gian khử trùng kéo dài làm cho chất khử trùng ngấm sâu vào mẫu làm cho mẫu bị chết nhiều từ đó dẫn tỷ lệ mẫu sạch giảm xuống.
Như vậy qua thí nghiệm cho thấy với thời gian khử trùng bằng HgCl2 trong 6 phút là cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ mẫu chết thấp nhất.