3.2. Kết quả bổ sung chế phẩm probiotic trên tôm hùm
3.2.1. Khả năng sinh trƣởng và hệ số tiêu thụ thức ăn của tôm thí nghiệm
nghiệm với mật độ cảm nhiễm tƣơng ứng 104 và 105 CFU/ml khác nhau không có ý nghĩa (P<0,05). Liều gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn V. owensii DY05 trên tôm thí nghiệm đƣợc xác định là 105,8 CFU/ml trong thời gian 20 ngày. Tổng số vi khuẩn
Vibrio đƣợc phân lập lại từ tôm hùm chết có mật độ dao động từ 3,5 x 103 CFU/g đến 7,1 x 103 CFU/g.
Vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh cơ hội, thƣờng tấn công trƣớc nhất vào các cá thể đã bị tổn thƣơng trƣớc đó, hoặc có tình trạng sức khỏe yếu hơn so với các cá thể khác trong đàn. Với t lệ chết tích lũy 85%, V. owensii DY05 gây chết khá nhanh cho tôm hùm con trong thời gian ngắn 13 ngày, t lệ chết tích lũy có tƣơng quan rất mạnh với nồng độ vi khuẩn cảm nhiễm (R=0,946) (P<0,01). Điều nay trùng với kết luận của Bourne và ctv (2004) khi nghiên cứu về quần xã vi sinh vật trong hệ thống nuôi tôm hùm bông. Các thay đổi về định tính và định lƣợng thành phần vi khuẩn trong hệ vi sinh có liên quan đến t lệ chết của tôm, trong khi đó mật độ vi khuẩn xâm nhiễm vào cơ thể tôm gia tăng theo thời gian nhƣng lại không liên quan với t lệ chết [26].
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tỷ lệ c t t c lũ y (%)
T ời ian t n iệm (n ày)
10^3 CFU/ml 10^4 CFU/ml 10^5 CFU/ml 10^6 CFU/ml 10^7 CFU/ml Đối chứng
Hìn 3. . Diễn i n tỷ lệ c t ở các n óm t m m đƣợc c m n iễm với các mật độ ác n au của V. owensii DY05
Năm 2006, khi nghiên cứu quá trình lây nhiễm vi khuẩn họ Vibrionaceae trên ấu trùng tôm hùm P. ornatus, Webster và ctv (2006) đã phát hiện mật độ vi khuẩn trung bình ở mô ngoài và trong gan tụy của ấu trùng tăng tƣơng ứng 5 và 40 lần ở ngày ƣơng nuôi thứ 18 so với ngày ƣơng nuôi đầu tiên, riêng mật độ vi khuẩn họ Vibrionaceae tăng tƣơng ứng 15 và 60 lần [123].
Vi khuẩn Vibrio đã đƣợc chứng minh là tác nhân gây bệnh (trực tiếp hay gián tiếp) trên tôm. Janarthanam và ctv (2012) khi nghiên cứu kiểm soát vi khuẩn V. harveyi đã tiến hành kiểm tra độ độc của hai chủng vi khuẩn V. harveyi và xác định đƣợc liều gây chết 50% của chúng trên tôm sú (Penaeus monodon) dao động 3,7 x 106 – 8,9 x 107 CFU/ml [58], tƣơng tự so với kết quả của thí nghiệm này. Trong thí nghiệm nghiên cứu cảm nhiễm vi khuẩn V. harveyi lên ấu trùng phyllosoma tôm hùm
Jasus verriauxi bằng phƣơng pháp tắm, Diggles và ctv (2000) đã kết luận ấu trùng chết 100% sau 3 ngày cảm nhiễm với V. harveyi ở mật độ 107 CFU/ml và ghi nhận ấu trùng đầu tiên chết ở mật độ cảm nhiễm 106 CFU/ml sau 7 ngày. Nhóm nghiên cứu cũng tiến hành kiểm tra mức độ nhạy cảm của ấu trùng phyllosoma J. verriauxi bị tổn thƣơng với vi khuẩn V. harveyi so với ấu trùng khỏe mạnh bằng phƣơng pháp tắm. Kết quả nghiên cứu đã kết luận đàn ấu trùng bị tổn thƣơng nhạy cảm hơn với V. harveyi
đồng thời t lệ chết của đàn ấu trùng này cũng cao hơn nhiều so với đàn ấu trùng khỏe mạnh [36].
Ngoài ra, Goulden và ctv (2012) khi nghiên cứu cảm nhiễm vi khuẩn V. owensii
DY05 lên ấu trùng tôm hùm P. ornatus bằng phƣơng pháp ngâm đã kết luận trong thời gian 5 ngày sau khi cảm nhiễm, ấu trùng phyllosoma chết 40% và 60% ở mật độ cảm nhiễm tƣơng ứng 105 và 107 CFU/ml. Đối với phƣơng pháp cảm nhiễm qua vector đã đƣợc tăng sinh với vi khuẩn cảm nhiễm (mật độ vi khuẩn tăng sinh 106 CFU/ml), t lệ chết của ấu trùng sau 5 ngày là 89%. Nghiên cứu của các tác giả đều kết luận vi khuẩn
Vibrio gây chết cho ấu trùng phyllosoma trong thời gian ngắn với t lệ chết tích lũy cao [49]. Trong nghiên cứu này, t lệ chết tích lũy cao trong thời gian dài hơn do điều kiện thí nghiệm khác với các thí nghiệm trƣớc đây: sức khỏe và giai đoạn sinh trƣởng khác nhau của đối tƣợng thí nghiệm (ấu trùng và tôm con), điều kiện dinh dƣỡng, yếu tố môi trƣờng nuôi, độc tính của các chủng vi khuẩn cảm nhiễm sử dụng... Vì vậy, có
thể mức độ xâm nhiễm và gây độc của vi khuẩn Vibrio lên vật nuôi là khác nhau, dẫn đến khả năng gây chết cho đối tƣợng nuôi là khác nhau.
3. . . Dấu iệu ên n oài đặc trƣn của t m m c t sau i c m n iễm với V. owensii DY05
Tôm bỏ ăn trƣớc khi chết 2 đến 3 ngày (trừ các cá thể chết đầu tiên ở bể thí nghiệm E). Chúng biểu hiện trạng thái lờ đờ, các phần phụ dƣờng nhƣ bị tê liệt, không phản ứng khi bị kích thích cơ học. Tôm thí nghiệm chết có các dấu hiệu vỏ dƣới bụng và đuôi của tôm chuyển sang màu đỏ gạch, phần cơ nối giữa đầu ngực với bụng lỏng lẻo, toàn bộ cơ mất màu sắc sáng tự nhiên và chuyển sang màu hồng hơi đỏ. Ngoài ra, không quan sát thấy tổn thƣơng hay những dấu hiệu nào khác trên cơ thể tôm bị chết.
Hìn 3. . Dấu iệu ên n oài đặc trƣn của n óm t m m t n iệm. Tôm
hùm cảm nhiễm với V. owensii DY05 (A+B) và tôm hùm đối chứng (C+D). Tôm thí nghiệm chết khi cảm nhiễm với vi khuẩn V. owensii DY05 có một số dấu hiệu ngoài giống với đặc điểm chung đƣợc mô tả trong nghiên cứu của một số tác giả trƣớc đây trên tôm hùm khi cảm nhiễm với các loài Vibrio khác nhau. Diggles và ctv (2000) thông báo các dấu hiện hôn mê, lờ đờ, xuất hiện các chấm đỏ nhỏ dọc suốt thân khi ấu trùng Jasus verriauxi chết do cảm nhiễm với vi khuẩn V. harveyi [36]. Võ Văn Nha (2004) khi nghiên cứu một số bệnh thƣờng gặp trên tôm hùm bông đã phát
hiện trên tôm hùm bị bệnh đỏ thân có mặt của nhiều vi khuẩn thuộc chi Vibrio mà trong đó chủ yếu là V. parahaemolyticus [9].
V. owensii DY05 là chủng vi khuẩn mới, đƣợc phân lập từ ấu trùng phyllosoma tôm hùm P. ornatus chết trong quá trình ƣơng nuôi ở Australia. Các dấu hiệu và biểu hiện của ấu trùng tôm bị bệnh không đƣợc nhóm nghiên cứu mô tả [30]. Mặt khác, chƣa tìm thấy nghiên cứu nào thông báo chủng V. owensii DY05 là tác nhân gây bệnh trên tôm hùm tự nhiên, tôm hùm nuôi hay các loài giáp xác khác trong các trại nuôi. Khả năng gây chết của chủng vi khuẩn này trên đối tƣợng nuôi chỉ đƣợc thông báo mới đây bởi Goulden và ctv (2012) khi nghiên cứu cảm nhiễm lên ấu trùng phyllosoma P. ornatus. Tuy nhiên nhóm nghiên cứu không thông báo các biểu hiện ngoài của ấu trùng bị chết [51].
3.1.3. Phân tích tổ c ức ọc của t m m n c t tron t n iệm
a. Tổ chức mang
Kết quả phân tích cho thấy sự co rút lớp biểu bì các tế bào ở cả các sợi mang sơ cấp và thứ cấp của tôm bị cảm nhiễm với vi khuẩn V. owensii DY05 so với tôm đối chứng. Đây có thể là hiện tƣợng gia tăng các tế bào ƣa kiềm trong máu ở các sợi mang sơ cấp.
Hình 3.3. Tổ c ức man t m đ i c ứn (A) và t m c m n iễm với V. owensii DY05 (B). Vật kính 40x (A), và 10x (B)
b. Tổ chức cơ ngực
Tổ chức cơ ngực của tôm đối chứng là một khối đặc, đƣợc liên kết chặt chẽ, trong khi đó tổ chức cơ ngực của tôm chết lại không có sự liên kết này. Các liên kết bị tách rời và đứt cho thấy khả năng phân mảnh liên kết cơ của vi khuẩn V. owensii DY05 mà không cần xâm nhập tế bào và tiến tới phân giải mô cơ. Có thể có sự liên quan giữa biểu hiện bỏ ăn của tôm là do ảnh hƣởng của vi khuẩn đã làm chậm (hoặc mất) khả năng tìm kiếm thức ăn dẫn đến dị hóa mô cơ để cung cấp năng lƣợng cho cơ thể và khả năng phân mảnh các liên kết của vi khuẩn dẫn đến phân giải mô cơ.
Hình 3.4. Tổ c ức cơ t m m. (A): Tổ chức cơ chặt chẽ của tôm đối chứng; (B):
Phân mảnh liên kết mô cơ và (C): Phân giải mô cơ ở tôm cảm nhiễm với V. owensii
c. Tổ chức ruột
Ruột của tôm cảm nhiễm có hiện tƣợng bị phân giải, phát hiện sự xâm nhập tế bào của vi khuẩn và gia tăng của các tế bào bạch cầu ƣa acid.
Hìn 3.5. Tổ c ức ruột t m đ i c ứn (A) và t m c m n iễm với V. owensii DY05 ị p ân i i m cơ (B). :Vùng vi khuẩn xâm nhập tế bào và tăng
bạch cầu ƣa acid. Vật kính 40x.
d. Tổ chức gan tụy
Gan tụy tôm hùm chết bị hoại tử nặng, tế bào gan tụy bị phá hủy. Phân tích tiêu bản cho thấy có sự tăng diện tích ở một số ống lumen, tế bào chất bị mất đồng thời cấu trúc thành ống gan tụy không còn đƣợc rõ ràng, tế bào biểu mô thành ống gan tụy bị bong tróc, có thể hiện tƣợng hoại tử đang diễn ra. Ở những mẫu tổ chức gan tụy bị mất hoàn toàn cấu trúc, phát hiện những đám đông đặc bất thƣờng trong các ống lumen. Các đám này có thể là các tế bào vi khuẩn tập trung hoặc máu của tôm chết đông lại. Dù trong trƣờng hợp nào thì ảnh hƣởng của vi khuẩn V. owensii DY05 đến hoại tử gan tụy trên tôm cũng đƣợc thể hiện rõ.
Kết hợp những dấu hiện bên ngoài và kết quả mô học của tôm chết, chúng tôi cho rằng chủng vi khuẩn V. owensii DY05 có khả năng xâm nhiễm hệ thống trên tôm hùm bông con. Điều này phù hợp với kết luận nghiên cứu của Goulden và ctv (2012) khi cảm nhiễm chủng V. owensii DY05 lên ấu trùng phyllosoma tôm hùm bông. Nhóm nghiên cứu đã ghi nhận các t lệ chết song không mô tả dấu hiệu ngoài mà tiến hành phân tích tổ chức mô bệnh học của ấu trùng bị chết và quá trình vi khuẩn xâm nhiễm vào cơ thể ấu trùng. Ngƣời ta đã phát hiện sự có mặt của vi khuẩn có roi trong gan tụy ấu trùng sau 6 giờ cảm nhiễm, hiện tƣợng gan tụy bị hoạt tử nặng xảy ra sau 42 giờ cảm nhiễm, và sự xâm nhiễm của chủng vi khuẩn này trên mô cơ ngực và mắt [49].
Hình 3.6. Tổ c ức an tụy của t m m. (A+ B): Tổ chức gan tụy nguyên vẹn của
tôm đối chứng; (C, D, E, F): tổ chức gan tụy của tôm hùm chết khi cảm nhiễm với chủng V. owensii DY05. : tổ chức gan tụy còn nguyên vẹn của tôm đối chứng;
: tổ chức gan tụy mất độ rõ ràng trong cấu trúc; : sự gia tăng diện tích các ống lumen; : sự xuất hiện các đám đông đặc bất thƣờng trong ống lumen. Vật
Kết quả nghiên cứu của Diggles và ctv (2000) cũng kết luận ấu trùng phyllosoma tôm hùm bông bị xâm nhiễm hệ thống bởi vi khuẩn V. harveyi. Trong nghiên cứu này, phân tích tổ chức học cho thấy một lƣợng lớn vi khuẩn trong ruột và trong ống gan tụy của ấu trùng, đồng thời ống gan tụy bị hoạt tử nặng, tế bào gan tụy bị phá hủy [36].
Chủng vi khuẩn V. owensii DY05 có độc tính rất mạnh [30] và đã đƣợc chứng minh là tác nhân gây chết trên ấu trùng tôm hùm bông [51]. Mới đây một chủng khác của loài V. owensii (chủng OCN002) đã đƣợc công bố là tác nhân gây bệnh hoại tử mô (hay bệnh đốm trắng Montipora) trên loài san hô Montipora capitata ở Hawaii [116]. Trong điều kiện thí nghiệm này, những kết quả trên chỉ ra rằng V. owensii DY05 có thể là tác nhân gây chết trên tôm hùm con. Đây là thông báo đầu tiên về thử nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn này trên tôm hùm sau giai đoạn ấu trùng. Trong các bệnh do vi khuẩn, bệnh do Vibrio đƣợc coi là nguyên nhân quan trọng gây sụt giảm sản lƣợng trong các trang trại nuôi tôm. Chẳng hạn, nhóm vi khuẩn này đã đƣợc chứng minh là truyền bệnh từ trại nuôi tôm cho tôm hùm tự nhiên ở miền Nam Iran. Bệnh gây ra bởi các loài vi khuẩn Vibrio đã đƣợc ghi nhận trên nhiều đối tƣợng nuôi hải sản nhƣ cá biển, tôm nƣớc lợ, và cả tôm [17]. Tall và ctv (2003) đã báo cáo thiệt hại kinh tế khoảng 2,5 triệu đô la do vi khuẩn giống với Vibrio fluvialis trên tôm hùm châu Mỹ gây ra [115]. Raissy và ctv (2011) đã phát hiện các loài vi khuẩn Vibrio spp. trong máu tôm hùm, trong đó các loài V. alginolyticus, V. vulnificus, V. harveyi, và V. mimicus
xuất hiện với tần số lớn hơn cả [89].
Bệnh vibriosis gây ảnh hƣởng ngày càng lớn đến phát triển nghề nuôi bền vững, gây sụt giảm kinh tế nghiêm trọng cho tất cả các quốc gia có nghề nuôi thủy sản. Trên tôm hùm nói riêng và trên giáp xác nói chung thiếu hệ đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, gây khó khăn trong ứng dụng công nghệ vaccine vào phòng bệnh. Trong khi đó, với tình trạng sử dụng thuốc và kháng sinh tràn lan nhƣ hiện nay đã làm phát triển một số chủng vi khuẩn kháng thuốc, gia tăng độc tính và khả năng lan truyền, đồng thời tích lũy các gốc kháng sinh trong cơ thể vật nuôi, gây hại cho ngƣời tiêu dùng thực phẩm từ các động vật này. Mới đây, Goulden và ctv (2012) đã tuyển chọn và thử nghiệm thành công hai chủng vi khuẩn probiotic (Vibrio sp. PP05 và Pseudoalteromonas sp. PP107), khi sử dụng kết hợp có thể tăng tỉ lệ sống của ấu trùng tôm hùm bông sau khi cảm nhiễm với V. owensii DY05 [52].
3. . K t qu ổ sun c p m pro iotic trên t m m
3.2.1. K năn sin trƣởn và ệ s tiêu t ụ t ức ăn của t m t n iệm
Nhằm hạn chế các tác động có thể gây “stress” cho tôm, khối lƣợng của tôm thí nghiệm chỉ đƣợc xác định vào hai thời điểm bắt đầu và kết thúc của thời gian bổ sung chế phẩm probiotic. Khối lƣợng trung bình, tốc độ sinh trƣởng riêng của tôm ở các bể sau khi kết thúc thời gian bổ sung probiotic không bằng nhau, đạt giá trị cao nhất ở bể C2, tiếp đến là bể B2 và thấp nhất ở bể A2. Các giá trị trên khác nhau có ý nghĩa sau thời gian thí nghiệm (P < 0,05). Ngƣợc lại với hai chỉ số trên, hệ số tiêu thụ thức ăn của tôm cao nhất ở bể A2 và thấp nhất ở bể C2. Số liệu đƣợc trình bày cụ thể trong và Bảng 3.2.
Kết quả thể hiện trên Bảng 3.2 và Bảng 3.3 đã cho thấy hai loại chế phẩm probiotic sử dụng đều có khả năng kích thích sinh trƣởng trên tôm hùm và giảm hệ số tiêu thụ thức ăn. Trong đó, chế phẩm probiotic 2 dƣờng nhƣ có hiệu quả tốt hơn chế phẩm probiotic 1 khi cho kết quả tốc độ sinh trƣởng riêng, khối lƣợng trung bình (cao hơn có ý nghĩa) của tôm cao hơn, đồng thời hệ số FCR lại thấp hơn.
B n 3.2. Một s c ỉ tiêu sin trƣởn và ệ s t ức ăn của t m m sau t ời gian ổ sun pro iotic
(Giá trị trun ìn ± Độ lệc c u n)
Chỉ tiêu Bể A2 Bể B2 Bể C2
Khối lƣợng tôm khi bắt đầu
thí nghiệm (g) 12,80 ± 0,853 12,03 ± 1,224 13,15 ± 1,166 Khối lƣợng tôm khi kết thúc
thí nghiệm (g) 50,05 ± 1,798 a 62,35 ± 1,527b 77,25 ± 1,896c Tốc độ sinh trƣởng riêng SGR (%/ngày) 2,27 ± 0,131 x 2,75 ± 0,189y 2,96 ± 0,151y Hệ số tiêu thụ thức ăn FCR 4,30 4,02 3,85
(a,b, c, x, y Trong cùng một hàng, các giá trị trung bình có kí tự viết lên trên không giống nhau thì sai khác có ý nghĩa, P < 0,05).
3.2. . Tỷ lệ s n của t m m và k năn ức c vi u n Vibrio ây ện
a. Tỷ lệ sống của tôm hùm thí nghiệm
Sau 60 ngày bổ sung chế phẩm probiotic, t lệ sống của tôm hùm thí nghiệm đƣợc trình bày trên Hình 3.7. Kết quả cho thấy nhóm tôm hùm đƣợc bổ sung chế phẩm probiotic 2 vào thức ăn có t lệ sống cao nhất (90,00%), tiếp đến là nhóm tôm hùm đƣợc bổ sung chế phẩm probiotic 1 (83,33%) và thấp nhất là nhóm tôm hùm đối chứng (73,33%). Theo kết quả đó, sử dụng chế phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn nuôi tôm đã giúp gia tăng t lệ sống (10% khi đƣợc bổ sung chế phẩm 1, và 16,67% đối với chế phẩm 2) của tôm hùm trong điều kiện thí nghiệm này.
Tôm hùm sau khi kết thúc thí nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic đƣợc cho cảm