trong việc phịng, trị bệnh
3.3.1.1 Phương pháp thu thập thơng tin và số liệu
- Số liệu thứ cấp: Các số liệu được thu thập từ các cơ quan cĩ liên quan như: Sở Nơng nghiệp và Phát Triển Nơng Thơn, Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản, Cục Thống Kê, Trung Tâm Khuyến Nơng để xác định số lượng và vị trí của các hộ nuơi ếch tại khu vực điều trạ
- Số liệu sơ cấp: được thu thập bằng phương pháp điều tra phỏng vấn trực tiếp và cĩ sử dụng bảng điều tra với 48 hộ sản xuất giống ếch và nuơi thương phẩm tại Quận 9, Củ Chi, Hĩc Mơn, Thủ Ðức. Nội dung chính của bảng câu hỏi bao gồm: Các đặc điểm chung của nghề nuơi tại nơng hộ; Loại thức ăn sử dụng và cách thức cho ăn; Nguồn nước và cách xử lý nguồn nước; Các dịch bệnh thường xảy ra trong quá trình nuơi (tập trung chủ yếu vào các bệnh: lở loét, đỏ chân, hoại tử ruột, mù mắt và quẹo cổ); Mùa vụ xảy ra dịch bệnh, kích cỡ ếch dễ bị nhiễm bệnh; Tình trạng chết của ếch
khi dịch bệnh xảy ra; Thuốc và phương pháp phịng trị bệnh của trại sản xuất; Hiệu quả của các loại thuốc đang được sử dụng; và các thơng tin khác cũng cần được thu thập đầy đủ.
3.3.1.2 Phương pháp phân tích và đánh giá
Các thơng tin thu thập sau quá trình điều tra được phân tích và xử lý bằng phần mềm MS Excel. Từđĩ, phân tích các yếu tốảnh hưởng đến năng suất ếch nuơi tại các nơng hộở vùng ven đơ Tp.HCM.
3.3.2 Nội dung 2: Xác định loại ký sinh trùng gây bệnh trên nịng nọc và ếch trưởng thành trong điều kiện nuơi tại vùng ven đơ.
3.3.2.1 Thu mẫu ếch
Mẫu nịng nọc, ếch cĩ trọng lượng 3 – 30g, 30 – 80g, >80g được thu ngẫu nhiên tại các trại nuơi ếch trong vùng nghiên cứu để xác định các nhĩm ký sinh trùng gây bệnh trên ếch như trùng bánh xe, nhĩm trùng lơng tơ và lơng roị... Mẫu thu phải cịn sống.
3.3.2.2 Thu mẫu ký sinh trùng
Đặt ếch lên khay inox, quan sát hình thái bên ngồi, quan sát các biểu hiện bên ngồi như xuất huyết, lở loét hay cĩ đốm trắng để chẩn đốn sơ bộ bệnh của ếch. Tiến hành hủy não ếch.
Dùng dao cạo lớp mỏng trên các vết thương. Sau đĩ dùng lamelle gạt nhẹ lớp nhớt, nhầy vừa lấy được lên lame, nhỏ từ 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý lên, dùng lamelle dàn mỏng lớp nhớt, nhầy đĩ đều khắp lame, quan sát dưới kính hiển vi để tìm ký sinh trùng.
Dùng pipette Pasteur hút ký sinh trùng sang một lame khác cĩ chứa nước muối sinh lý, thao tác này được lặp lại nhiều lần cho đến khi ký sinh trùng sạch nhớt. Sau đĩ đặt lammelle lên và quan sát dưới kính hiển vi ởđộ phĩng đại 10X, 40X.
3.3.2.3 Phương pháp cố định mẫu soi tươi
Nhỏ ammonia 1% lên ký sinh trùng sống đã được làm sạch để trùng duỗi ra, đậy lammelle lên và quan sát hình thái dưới kính hiển vị
3.3.2.4 Nhuộm mẫu ký sinh trùng bằng Carmine
Nước trên lame cĩ chứa ký sinh trùng được rút bớt ra, dùng lammelle ép nhẹđể ký sinh trùng duỗi thẳng. Nhuộm Carmine đến khi thấy ký sinh trùng cĩ sự bắt màu rõ
Nhỏ Gelatin – Glycerin lên lame để giữ mẫu, đậy lammelle và gắn bằng Baume Canadạ
3.3.2.5 Định danh ký sinh trùng
Ðịnh danh bằng hệ thống phân loại của một số tác giả: Hà Ký, Bùi Quang Tề (1991) và Lom (1992). So sánh với kết quả nghiên cứu của Thái Lan.
3.3.2.6 Phương pháp xác định cường độ cảm nhiễm (CĐCN) và tỷ lệ cảm nhiễm (TLN)
- Tỷ lệ cảm nhiễm (%): (sốếch bị nhiễm ký sinh trùng/tổng sốếch được kiểm tra) * 100
- Cường độ cảm nhiễm: số lượng ký sinh trùng/lame
3.3.3 Nội dung 3: Xác định loại vi khuẩn gây bệnh lở loét, sình bụng và mù mắt trên ếch (R. tigerina) nhập từ Thái Lan trong điều kiện nuơi tại vùng ven đơ.
3.3.3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn từ ếch bệnh tại các hộ nuơi ở vùng ven đơ Tp.HCM
Thu mẫu: Mẫu ếch bệnh lở loét, sình bụng, mù mắt và mẫu nước được thu từ các trại sản xuất trong phạm vi nghiên cứụ Triệu chứng ếch bệnh và điều kiện mơi trường nước được ghi nhận một cách đầy đủ trong khi thu mẫụ
Sau khi kiểm tra hình thái bên ngồi của ếch thì tiến hành mổ và quan sát bên trong cơ thểếch:
- Trước khi giải phẫu ếch phải tiến hành khử trùng bề mặt da ếch bằng cồn 70o. - Sau đĩ thực hiện các thao tác giải phẫu: Đầu tiên hủy tủy sống ếch bằng cách dùng kim đâm vào giữa khớp xương sọ và cột sống. Dùng kéo cắt một chỗ nhỏ tiếp giáp 2 chân sau, luồn kéo cắt thẳng tới cổ, sau đĩ cắt ra 2 chi trước và 2 chi saụ Tháo da ra 2 bên sẽ thấy cơ ngực và cơ bụng cĩ hình tam giác. Cắt cơ theo chu vi hình tam giác này, cắt ngang khớp giữa xương cánh tay và đai vai, nối 2 đường cắt nàỵ
- Quan sát trạng thái của các nội quan xem cĩ biểu hiện khác thường so với ếch khỏe khơng.
Hình 3.1: Mổ và quan sát nội tạng của ếch Phương pháp xác định vi khuẩn gây bệnh:
- Lấy mẫu vi khuẩn từ da, vết lở loét, mắt, máu tim, thận, gan, lách và ruột từ ếch bệnh thu được tại các trại sản xuất giống và nuơi thương phẩm;
- Cấy ria phân lập vi khuẩn lên mơi trường NA (Nutrient Agar) và TSA (Tryptone Soya Agar), nuơi cấy 18 – 24 giờ.
- Cấy trang vi khuẩn trên PCA (Plate Count Agar) nhằm xác định chủng lồi vi khuẩn hiện diện chủ yếu trong mẫu bệnh. Cấy thuần; nhuộm GRAM; quan sát hình thái tế bào; khả năng di động của vi khuẩn; phản ứng oxidase và catalasẹ
- Tiến hành định danh vi khuẩn dựa trên các phản ứng sinh hĩa bằng bộ test IDS 14GNR của cơng ty Nam Khoa đối với các chủng vi khuẩn thu Đợt 1 và bộ kit API-20E (BioMerieux, Pháp) đối với các chủng vi khuẩn thu Đợt 2 và theo khĩa phân loại của BergeỵSo sánh với kết quả nghiên cứu của Thái Lan.
Giữ giống trong mơi trường NB (Nutrient Broth) cĩ bổ sung 50% glycerol ở nhiệt độ -20oC.
Hình 3.2: Sơđồ phân lập và định danh vi khuẩn từếch bệnh
3.3.3.2 Gây bệnh thực nghiệm trên ếch bằng Vibrio metschnikovii, Pseudomonas cepacia, Xanthomonas malthophila, Aeromonas hydrophila phân lập từ ếch bệnh lở loét
Những dịng vi khuẩn được chọn để gây bệnh thực nghiệm vì chúng cĩ tần suất xuất hiện khá cao trong quá trình phân lập vi khuẩn từ ếch bệnh nuơi ở vùng ven đơ Tp.HCM.
a/ Gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với dịng vi khuẩn V. metschnikovii, P. cepacia, X. malthophila phân lập từếch bị lở loét:
- Ếch giống khỏe mạnh cĩ trọng lượng trung bình từ 25 – 35g. Ếch được bố trí trong bể kính cĩ thể tích 40x30x35cm với mật độ 10 con/bể. Ếch được cho ăn bằng thức ăn viên cĩ 30% đạm với lượng thỏa mãn.
- Nguồn nước thí nghiệm là nước máy đã được xử lý bằng chlorinẹ
- Vi khuẩn thí nghiệm: Phân lập cho thí nghiệm là 3 dịng vi khuẩn V. metschnikovii, P. cepacia, X. malthophila từếch bị lở loét cơ quan nội tạng (gan, thận, tỳ tạng) bị đốm mủ màu trắng. Các vi khuẩn này được định danh bằng bộ định danh IDS 14GNR của cơng ty Nam Khoạ
- Thời gian thí nghiệm là 14 ngàỵ Vị trí lấy mẫu bệnh Phân lập, làm thuần Nhuộm Gram Oxidase Di động Định danh sơ bộ + 1 - 2 + 4 + 1 + 2 - 4 + 1 - 2 - 4 + 1 - 2 + 4 5 3 1 5 + 1 - 2 4 - + 1 + 2 + 4 + 1 + 2 - 4 1 7 3 Giữ giống Định danh
- Đối với mỗi loại vi khuẩn thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại:
+ Nghiệm thức 1: Đối chứng tiêm nước muối sinh lý + Nghiệm thức 2: 1x102 cfu/ml
+ Nghiệm thức 3: 1x104 cfu/ml + Nghiệm thức 4: 1x106 cfu/ml
Gây bệnh bằng cách tiêm vào đùi ếch với thể tích huyền dịch vi khuẩn khơng quá 0,2ml/cá thể. Lơ đối chứng: ếch được tiêm nước muối sinh lý với thể tích tương ứng. Mỗi ngày tiến hành kiểm tra và ghi nhận những biểu hiện bất thường như ếch bỏ ăn, xuất hiện dấu hiệu bệnh tích, số lượng ếch bệnh và chết. Phân lập, tái định danh vi khuẩn từếch bệnh và tồn bộếch sau thời gian kết thúc thí nghiệm.
b/ Gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với dịng vi khuẩn Ạ hydrophila phân lập từếch bị lở loét:
- Ếch giống khỏe mạnh cĩ trọng lượng trung bình từ 18 - 25g. Ếch được bố trí trong bể kính cĩ thể tích 40x30x35cm với mật độ 10 con/bể. Ếch được cho ăn bằng thức ăn viên cĩ 30% đạm với lượng thỏa mãn.
- Nguồn nước thí nghiệm là nước máy đã được xử lý bằng chlorinẹ - Thời gian thí nghiệm là 14 ngàỵ
- Vi khuẩn thí nghiệm: Phân lập cho thí nghiệm là dịng vi khuẩn Ạ hydrophila
từ ếch bị lở loét và cơ quan nội tạng (gan, thận, tỳ tạng) bị đốm mủ màu trắng. Vi khuẩn này được định danh bằng bộđịnh danh API-20E (BioMerieux, Pháp)
- Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại:
+ Nghiệm thức 1: Đối chứng tiêm nước muối sinh lý + Nghiệm thức 2: 9x106 cfu/ml
+ Nghiệm thức 3: 9x107 cfu/ml + Nghiệm thức 4: 9x108 cfu/ml
Gây bệnh bằng cách tiêm vào đùi ếch với thể tích huyền dịch vi khuẩn khơng quá 0,2ml/cá thể. Lơ đối chứng: ếch được tiêm nước muối sinh lý với thể tích tương ứng. Mỗi ngày tiến hành kiểm tra và ghi nhận triệu chứng, số lượng ếch bệnh và chết. Phân lập, tái định danh vi khuẩn từếch bệnh và tồn bộếch sau thời gian kết thúc thí nghiệm.
Hình 3.4: Bể bố trí thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm