ngô, đó là: “nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy in vitro phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen ở ngô
(Zea mays [11].
Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trƣờng N6 bổ sung 2,4-D 7 mg/l; casein 100 mg/l; L-prolin 2,88 mg/l; sucrose 40 g/l; agar 8 g/l cho tạo cao
nhất. 25 - 27 ngày đối với vụ đông,
phôi 18 - 20 ngày đối với vụ hè.
dòng
2 dòng ngô HR8 và HR9 đạt lần lƣợt là 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9% và 21,4% [14].
Nguyễn Văn Đồng (2009), tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từ phôi non của 45 dòng ngô Việt Nam thuộc 3 nhóm ngô tẻ, ngô nếp và ngô ngọt, sử dụng dòng đối chứng là dòng ngô mô hình HR8 có khả năn
[4].
1.3. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng và thành phần môi trƣờng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sinh trƣởng, phân chia tế bào và kiểm soát sự biệt hóa cũng nhƣ phát sinh hình thái của thực vật. Trong nuôi cấy tế bào in vitro, các chất điều hòa sinh trƣởng là thành phần quan tr
, loại mô, hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng nội sinh của chúng. Các chất
cytokinin [15].
Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol axetic (IAA) nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng n
. Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (2,4-D, IBA, NAA …) [8]. Trong nuôi cấy in vitro, auxin có tác dụng kích thích sinh trƣởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trƣởng của mẫu thô
tác dụng kích thích sự hình thành phôi vô tính trong dung dịch huyền phù nuôi cấy [8], [15].
Tùy theo loại auxin, hàm lƣợng sử dụng và đối tƣợng nuôi cấy mà tác dụng sinh lí của auxin là kích thích sinh trƣởng mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn tới hình thành mô sẹo [3]. Nồng độ auxin thấp dẫn tới sự hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới hình thành mô sẹo. Tuy nhiên nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển của rễ. Hàm lƣợng IAA có thể sử dụng từ 1 - 50 mg/l. Hàm lƣợng IAA và NAA thƣờng sử dụng từ 0,1 - 10 mg/l. Còn 2,4-D đƣợc bổ sung vào môi trƣờng cho hiệu quả tạo mô sẹo ở nhiều loại thực vật [1], [18].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô cây ngũ cốc đã đƣợc Bhaskaran và Smith (1990) tổng kết. Nhìn chung, chất điều hòa sinh trƣởng nhóm auxin điển hình là 2,4-D với nồng độ 1 - 3 mg/l cần thiết cho sự hình thành mô sẹo phôi hóa từ phôi hợp tử. 2,4-D là yếu tố quan trọng trong sự khởi đầu phát triển của mô sẹo và mô sẹo có khả năng tạo phôi từ phôi non ngô [20].
2,4-D là chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng phổ biến nhất để cảm ứng tạo mô sẹo từ phôi. Việc bổ sung các citokynin kết hợp với 2,4-D có thể làm tăng phản ứng của phôi trong một số loài cỏ. Kiểu gen là một yếu tố có vai trò cơ bản trong quá trình phôi cảm ứng ngô [27], [35], [36], [51].
Khi nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non dòng ngô lai F1 (M947 x M948) và (M950 x M951) của Das (2001) cho thấy môi trƣờng MS có bổ sung 2,4-D 2 mg/l là hiệu quả nhất [26]. Sairam (2003) cũng đã tạo đƣợc mô sẹo từ các mẫu mô phân sinh chồi đỉnh với tần số tƣơng đối cao (80%) khi bổ sung 2,4-D 5 mg/l vào môi trƣờng nuôi cấy.
Shohael (2003) nghiên cứu ảnh hƣởng của 2,4-D đến sự tạo
phôi của 3 dòng ngô CML-161; CML-323; CML-327 kết luận nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ cao nhất [42]. Ombori (2008) đã sử dụng nồng độ 2,4-D 1,5 - 2,5 mg/l và thấy các dòng ngô có nồng độ 2,4-D tối ƣu khác nhau [39].
Cytokinin
. Loại cytokinin đầu tiên phát hiện đƣợc là zeatin tách từ mầm ngô. Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác nhƣ kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [8]. Cytokinin liên quan tới sự phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm hiện tƣợng ƣu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy. Hàm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lƣợng cytokinin cao sẽ hoạt hóa thành chồi bất định, chồi nhiều nhƣng kích thƣớc nhỏ [17]. Các cytokinin thƣờng dùng là: BAP, kinetin…
Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BAP có thể kích thích nhiều quá trình, BAP đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tƣợng thực vật và mục đích nuôi cấy [8].
Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lƣợng cao nhất trong phôi và trong quả đang phát triển. H
- [8].
Việc sử dụng chất điều hòa sinh trƣởng nhóm cytokinin kết hợp với auxin trong quá trình hình thành phôi soma từ các mẫu mô sẹo của các cây ngũ cốc cũng đã đƣợc nghiên cứu. Theo Cho (1998), bổ sung BAP 0,1 mg/l kết hợp với 2,4-D 2 mg/l vào môi trƣờng nuôi cấy là rất cần thiết đối với sự hình thành và duy trì mô sẹo phôi hóa [25].
1 m
21 [22]. -
[33].
Nghiên cứu của Huang và Wie (2004) cho thấy môi trƣờng nuôi cấy bổ sung 2,4-D 2 mg/l kết hợp với BAP 0,2 mg/l làm tăng hiệu quả tạo mô sẹo phôi hóa từ phôi non của 2 dòng ngô nội phối C8605 và 9046 [34].
của thành phần môi trường của nitrat bạc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
250 100
[45].
Vain (1989) là ngƣời đầu tiên đi sâu nghiên cứu về ảnh hƣởng của nồng độ AgNO3 đến khả năng tạo dạng II. Tác giả nhận thấy tỷ lệ
dạng II tăng lên khi phôi non đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS bổ sung AgNO3 (0, 5, 10 và 20 mg/l) và AgNO3 không ảnh hƣởng đến sự phát triển của . Nitrat bạc một chất ức chế hoạt tính của ethylene nội sinh. Ethylene đƣợc hình thành trong quá trình nuôi cấy in vitro
ảnh hƣởng tới phân chia và biệt hóa của tế bào. vậy, bổ sung nitrat bạc vào môi trƣờng nuôi cấy kích thích sự tạo thành mô sẹo và tái sinh cây [47].
Vai trò của L-proline
Armstrong và Green (1991) đã nghiên cứu vai trò của L-proline trong việc duy trì mô sẹo xốp và mô sẹo có khả năng tạo phôi dòng ngô A188. Tác giả tạo mô sẹo và duy trì hơn một năm mà mô sẹo vẫn xốp, không mất khả năng phôi hóa. Tỷ lệ tạo mô xốp và mô sẹo phôi hóa tăng với bổ sung L-proline đến 25 mM vào môi trƣờng N6 [21].
Binott (2005) nhận định rằng nồng độ L-proline 1,87 g/l (10 mM) tạo tốt nhất đó có những nghiên cứu chỉ ra rằng L-proline thích hợp nhất là 2,3 g/l (20 mM) [23].
Vai trò của đường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
[40]. -
[18], [15].
Garcial và Molina (1988) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của sucrose đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi ngô non có kích thƣớc từ 1,2 -
5%, có ảnh hƣởng rõ rệt đến quá trình nuôi cấy phôi kích thƣớc nhỏ. Các nghiên cứu khác cho thấy, nồng độ sucrose thấp dƣới 2% kích thích sự hình thành mô sẹo dạng II, nồng độ sucrose 6% kích thích sự hình thành mô sẹo dạng I [30].
1.3.3. in vitro
in vitro
: nuôi cấy phôi hợp tử (nuôi cấy phôi non, phôi trƣởng thành), nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy noãn , nuôi cấy mô phân sinh.
Nuôi cấy phôi non nhằm tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu gây đột biến, chọn dòng vô tính, nuôi cấy tế bào trần, chuyển gen và phân lập gen. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy phôi non phụ thuộc vào: kiểu gen, tuổi phôi, thành phần môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy.
Nuôi cấy phôi trƣởng thành có ƣu điểm so với nuôi : phôi dễ tách,
.
Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời ở ngô thƣờng gặp khó khăn hơn so với nuôi cấy bao phấn các cây trồng quan trọng khác. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy bao phấn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu gen, môi trƣờng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nuôi cấy, thao tác vô trùng, các bi
.
Nuôi cấy noãn chƣa thụ tinh là một tro
thuật nuôi cấy.
Hệ thống nuôi cấy mô phân sinh chồi có ƣu điểm là ít phụ thuộc vào kiểu gen, thao tác tách mô phân sinh nhanh và đơn giản hơn so với việc tách phôi non. Mô phân sinh đỉnh chồi là hệ thống nuôi cấy tái sinh tiềm năng đối với các nghiên cứu biến nạp di truyền ở cây ngô. Nhƣng trong thực tế thƣờng gặp khó khăn lớn trong
mục đích làm sạch virus cho cây trồng. Độ lớn của chồi (mô) nuôi cấy có mối tƣơng quan chặt chẽ với tỷ lệ sống, khả năng cảm ứng và mức độ ổn định về mặt di truyền. Nếu độ lớn chồi tăng thì tỷ
tối .
Ngoài đỉnh sinh trƣởng là bộ phận nuôi cấy dễ thành công thì các bộ phận còn lại của cây ngô cũng có thể sử dụng cho việc nhân giống in vitro, chẳng hạn nhƣ đoạn thân, mảnh lá. [15]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phôi non và thân non củ : LVN 25, LVN 61,
LVN 66, LVN 99, LVN 885 do Viện Nghiên cứu ngô cung cấp.
LVN 25 LVN 61 LVN 66 LVN 99 LVN 885 - 85 - 95 ngày 95 - 105 ngày 95 - 120 ngày 95 - 110 ngày Năng suất 8 - 12 (tấn/ha) 8 - 12 (tấn/ha) 8 - 12 (tấn/ha) 9 - 12 (tấn/ha) 8 - 10 (tấn/ha) Tính chống chịu . Chống chịu gãy đổ khá, chịu hạn tốt, kháng sâu bệnh. Chịu đổ, chịu hạn, chịu úng và chịu sâu bệnh tốt. Chịu hạn khá, chống đổ tốt, ít nhiễm bệnh, độ đồng đều cao. Chịu hạn tốt, kháng bệnh, thích ứng rộng.
: Viện Nghiên cứu ngô)
2.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất
).
Chất khử , C2H5OH 70%, C2H5OH 90%.
ởng: BAP, 2,4-D, NAA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thiết bị
sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, bao gồm: cân phân tích, nồi hấp vô trùng, tủ cấy và các thiết bị khác.
2.3. Phạm vi nghiên cứu
.
.
2.4. Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Khoa học sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu sử dụng các phƣơng pháp thƣờng quy của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhƣ khử trùng mẫu, tái sinh cây trực tiếp từ phôi non, tạo mô sẹo, tái sinh cây từ mô sẹo…
8/2014.
.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
70o .
, lặp lại 3 lần.
2.5.1. Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non
[32].
Thí nghi m 1:
.
MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l, agar 7,5 g/l, hydrolyzed casein 100 mg/l; pH 5,8. Thí nghiệm 2: . 20, 30, 40, 50, 60 g/l. Đánh giá: , nhiệt độ 26o C 1o :
Tỷ lệ tái sinh (%) = số mẫu tái sinh x 100 số mẫu cấy
Chất lƣợng cây:
+ Cây tốt: cây khỏe, lá xanh, rễ khỏe.
+ : cây khỏe, lá hơi úa vàng, rễ ít phát triển. + Cây kém: cây yếu còi cọc, lá úa, rễ kém.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.5.2. Tạo mô sẹo từ phôi và thân non
thì phôi non cần .
Phôi non
[32].
Tạo mô sẹo từ phôi
Môi trƣờng nền tạo mô sẹo: M1 =
2,4-D, L-proline, AgNO3 . 5,8. Thí nghiệm 3: . 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ngày sau thụ phấn
trên môi trƣờng M - tuổi phôi
thích hợp nhất . Thí nghiệm 4: - . - 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 mg/l, thu đƣợc môi trƣờng M2 có tỷ lệ 2,4-D thích hợp nhất .
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hƣởng của L-proline đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non.
Trên môi trƣờng M2, L-proline 1,5; 1,8; 2,0; 2,2; 2,5; 2,8; 3,0 g/l thu đƣợc môi trƣờng M3 có nồng độ L-proline thích hợp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hƣởng của AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non.
Trên môi trƣờng M3, AgNO3 1; 1,5; 2; 3; 5; 7;
9; 11 mg/l tìm đƣợc môi trƣờng M4 có nồng độ AgNO3 thích hợp nhất. Nhƣ v y, môi trƣờng M4 là phù hợp nhất tạo mô sẹo .
Tạo mô sẹo từ thân non
70o
.
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hƣởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ thân non.
Trên môi - nồng độ 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7
mg/l. Thu đƣợc môi trƣờng có tỷ lệ 2,4-D thích hợp nhất thân non.
Đánh giá:
.
mô sẹo từ thân non 30 ngày
. công thức: 100 % Nt Ncp Ci
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Nt: tổng số phôi nuôi cấy. Ci: tỷ lệ tạo mô sẹo.
Hình thái: quan sát hình thái mô sẹo để nhận định mô sẹo là loại I hay loại II theo mô tả của Amstrong và Green, 1985 [20].
2.5.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh cây từ mô sẹo
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hƣởng của các nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo.
0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l. Đánh giá: , theo : 100 % Nsv Nr Rc
Trong đó: Rc: tái sinh cây. Nr: tổng số mô tái sinh. Nsv: tổng số mô nuôi cấy. Số chồi trung bình tính theo công thức:
2.5.4. Nghiên cứu điều kiện đưa cây in vitro ra ngoài môi trường
Thí nghiệm 9: nh hƣởng của các loại giá thể khác nhau
đến khả năng sống sót của cây con in vitro.
giá thể cát sạch, đất , cát sạch + trấu hun (tỷ lệ 1:1). Tổng số chồi
Số chồi trung bình/ mô = Tổng số mô tái sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đánh giá:
Chiều cao cây = Σ chiều cao cây sau 15 ngày - Σ chiều cao ban đầu (cm) Số lá = Σ số lá trên cây sau 15 ngày - Σ số lá ban đầu Chất lƣợng cây:
+ Cây tốt: cây khỏe, lá xanh.
+ Cây trung bình: cây khỏe, lá hơi úa vàng. + Cây kém: cây yếu còi cọc, lá úa.
2.6. Xử lý số liệu
Sử dụng toán thống kê: mỗi mẫu nghiên cứu nhắc lại ba lần, các số liệu đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Excel. Các phƣơng pháp sử dụng là phƣơng pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis, phƣơng pháp phân tích phƣơng sai một nhân tố.
số cây sống
Tỷ lệ cây sống % = x 100 tổng số cây đƣa ra
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non
25, LVN 61, LVN 66, LVN
:
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi phôi đến khả năng tái sinh cây trực tiếp từ phôi non
tôi tiến hành thu b 14 ngày, 16 ngày, 18 ngày, 20 ngày, 22 ngày, 24 ngà
+ agar 7,5 g/l + hydrolyzed casein 100 mg/l + sucrose 30 g/l 3.1. Bảng 3.1. ) (%) cây LVN 25 LVN 61 LVN 66 LVN 99 LVN 885 14 86,67 ± 0,7 88,89 ± 0,2 84,44 ± 0,1 91,11 ± 0,1 86,67 ± 0,3 ++ 16 91,11 ± 0,1 88,89 ± 0,1 88,89 ± 0,3 91,11 ± 0,3 88,11 ± 0,1 +++ 18 88,89 ± 0,3 91,11 ± 0,2 91,11 ±0,4 95,56 ± 0,1 88,89 ± 0,2 +++