Khảo sát thời gian tích góp từ 60 – 240 s. Chuẩn bị dung dịch MLC chuẩn có
nồng độ 2 µg /mL. Các điều kiện thí nghiệm như bảng 1, thay thời gian tích góp để
Hình 9. Phổ đồ của 2 µg / mL MLC ở các thời gian tích góp khác nhau: 1 – tích góp 60s; 2 – tích góp 90s; 3 – tích góp 120s ;4- tích góp – 180s; 5- tích góp 240s.
Nhận xét:MLC được tích góp lên trên bề mặt điện cực nhờ quá trình hấp phụ trước
khi ghi phổ. Thời gian tích góp ảnh hưởng đến độ nhạy của quá trình phân tích. Cường độ tín hiệu phân tích tăng khi tăng thời gian tích góp từ 60s – 120s cho thấy sự tăng
nồng độ MLC trên bề mặt điện cực (khi tăng từ 60 s lên 120s cường độ dòng tăng gấp đôi). Tuy nhiên, sự bao phủ bão hòa trên bề mặt cũng đạt được và cường độ không tăng đáng kể khi tăng thời gian tích góp từ 180s – 240s (cường độ pic không tăng tuyến tính
gấp 3, 4 lần so với cường độ pic ở thời gian tích góp 60 s). Chứng tỏ, sự hấp phụ MLC
lên bề mặt điện cực GC rất nhanh và dễ đạt được trạng thái bão hòa, tích góp vừa đủ đỡ
tốn thời gian và dễ làm sạch bề mặt điện cực và tránh được hiện tượng ngộ độc điện
cực. Chúng tôi chọn thời gian tích góp là 120 s để tiến hành phân tích. 3.2.8. THẾ TÍCH GÓP
Khảo sát thế tích góp: do tính chất bề mặt điện cực là trơ về mặt điện hóa, hóa
V. Các điều kiện thí nghiệm như bảng 1, thay giá trị thế tích góp để khảo sát, kết quả như bảng 6 và hình 10.
Bảng 6: Cường độ dòng Meloxicam 2 µg/ mL tại các giá trị thế tích góp hấp phụ:
Thế tích góp - 0.10 V 0.00 V + 0.10 V
I (µA) 8.0506 8.1815 7.0014
Hình 10 . Phổ đồ của 2 µg / mL MLC ở các thế tích góp khác nhau: 1 –thế tích góp +0.1V; 2 –thế tích góp - 0.1V; 3 –thế tích góp 0.0V.
Nhận xét: Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi chọn thế tích góp 0.0V để đảm bảo
không có sự khác biệt giữa các lần phân tích.
3.2.9. TỐC ĐỘ QUÉT THẾ VÀ BIÊN ĐỘ XUNG
+ Tốc độ quét thế:
- Thiết bị dùng để nghiên cứu đề tài có các giá trị quét thế : 5 mV/s, 10 mV/s, 20 mV/s, 50 mV/s. Khi khảo sát tốc độ quét 10 mV/s cho tín hiệu phân tích tốt hơn 5
mV/s, độ phân giải cao. Còn khi áp tốc độ quét thế 20 mV/s thì pic bị méo không thể định lượng, tốc độ 50 mV/s thì có tín hiệu vượt giá trị thang đo. Khi quét ở tốc độ cao
có khả năng chất cần phân tích chưa hòa tan kịp nên kết quả không có tính định lượng. Do đó chúng tôi chọn tốc độ quét thế 10 mV/s.
+ Biên độ xung: Thiết bị có biên độ xung 25 mV, 50 mV và 100 mV. Cài đặt các biên độ xung với các thông số khác nhau là: 25 mV, 50 mV và 100 mV để khảo
sát thì thu được các giá trị như trong bảng 7 và trong hình 11. Khi biên độ xung là 100 mV thì giá trị vượt thang đo. Vì thế, chúng tôi cố định biên độ xung là 50 mV.
Bảng 7. Cường độ dòng của Meloxicam 2 µg/ mL tại các biên độ xung:
Biên độ xung ( mV) I (µA)
25 2.2164
50 8.1898
Hình 11. Phổ đồ của 2 µg / mL MLC ở các biên độ xung khác nhau: 1 – biên độ 25 mV; 2 – biên độ 50mV.
Trong quá trình tích góp cần phải khuấy trộn dung dịch để chất phân tích hấp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phụ tốt lên bề mặt điện cực. Khảo sát tốc độ khuấy trong khoảng từ 2V đến 10V tương
ứng với 340 RPM – 2400 RPM và thu được kết quả như trong bảng 8 và hình 12 như
sau:
Bảng 8: Cường độ dòng Meloxicam 2 µg/ mL tại các giá trị tốc độ khuấy:
Tốc độ khuấy (V) I (uA) 2 (340 RPM) 5.3529 3 (600 RPM) 5.3780 5 ( 1120 RPM) 6.0633 7 ( 1640 RPM) 8.3382 10 ( 2000 RPM) 7.7851 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 5 10 Tốc độ khuấy (V) I(uA)
Hình 12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên cường độ pic của 2 µg /mL MLC, thế hoạt hóa +1.8 V trong 240s, thời gian hấp phụ 120s, ν = 10 mV/s .
Nhận xét: Tốc độ khuấy càng tăng thì cường độ pic tăng (340 RPM – 1640 RPM)
nhưng sự suy thoái điện cực lại diễn ra mạnh ( khi tăng đến 2000 RPM cường độ pic
giảm xuống). Vì thế, trong thực nghiệm, chúng tôi chọn tốc độ khuấy trung bình 1640 RPM .
3.2.11. CÁC CHẤT GÂY NHIỄU
3.2.11.1.CÁC CHẤT CÙNG HỌ OXICAM NHƯ PIROXICAM,
TENOXICAM:
Cùng họ oxicam: piroxicam và tenoxicam, có cấu trúc tương tự như Meloxicam.
Tuy nhiên, trong mẫu dược phẩm khi có Meloxicam sẽ không có piroxicam và
tenoxicam. Do đó, nghiên cứu về phản ứng oxi hóa của piroxicam và tenoxicam sẽ được tiếp tục nghiên cứu thêm nữa trong đề tài khác.
3.2.11.2. ẢNH HƯỞNG CỦA LACTOSE:
Lactose sử dụng làm tá dược trong thuốc với hàm lượng khá lớn. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Lactose từ 0 đến 200 µg/mL cho kết quả như trong bảng 9 và hình 13:
Bảng 9. Các số liệu khảo sát ảnh hưởng của Lactose:
C Lactose (µg/mL)
0 10 40 80 120 160 200
Ảnh hưởng của Lactose lên cường độ MLC 2 ug/m L 3 4 5 6 7 8 9 0 50 100 150 200 C Lactose ( ug/m L) I(uA)
Hình 13. Ảnh hưởng của Lactose lên cường độ pic của 2 µg /mL MLC, thế hoạt hóa +1.8 V trong 240s, thời gian hấp phụ 120s, ν = 10 mV/s .
Nhận xét: Hình 13 cho thấy nồng độ Lactose càng lớn thì cường độ pic càng giảm do độ nhớt dung dịch tăng lên. Như vậy, nồng độ Lactose ảnh hưởng đến độ nhạy của
phương pháp. Tuy nhiên, trong mẫu thuốc Lactose thường có nồng độ từ 8 – 17 µg/L
và Lactose hầu như không tan trong dung môi DMF (dùng để hòa tan MLC trong quá trình xử lý mẫu). Vì thế, phần lớn Lactose đã được loại bỏ trong quá trình lọc mẫu.
3.2.11.3. ẢNH HƯỞNG CỦA URE:
* Mẫu nước tiểu có chứa một lượng lớn Ure nên cần phải nghiên cứu ảnh hưởng
của nó cũng như của acid Uric (thường có trong nước tiểu người mắc bệnh Gout) lên
việc xác định MLC tron mẫu nước tiểu.
+ Ở đây, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của Ure trên cường độ pic của MLC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các thông số như bảng 1, nồng độ Ure từ 0 – 200 µg/L cho vào cùng với MLC chuẩn,
Bảng 10. Các số liệu khảo sát ảnh hưởng của Ure:
C Ure (µg/mL) 0 2 10 20 40 80 160 200
I (µA) 8.1978 7.5093 7.1805 7.0268 6.7540 6.3957 5.8189 5.5202
Ảnh hưởng của Ure trên cường độ pic của MLC 2ug/mL
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 50 100 150 200 Nồng độ Ure (ug/m L) I (uA)
Hình 14. Ảnh hưởng của Ure trên cường độ pic MLC 2 (µg/mL), thế hoạt hóa +1.8 V trong 240s, thời gian hấp phụ 120s, ν = 10 mV/s .
Nhận xét: Hình 14 cho thấy, nồng độ Ure ảnh hưởng đáng kế đến cường độ pic
MLC. Nồng độ Ure càng lớn thì cường độ pic càng giảm. Trong mẫu nước tiểu luôn có lượng Ure đáng kể, vì thế, chúng tôi dùng phương pháp thêm chuẩn để loại bỏ nền khi
xác định MLC trong mẫu nước tiểu.
+ Acid Uric thường có trong mẫu nước tiểu của các bệnh nhân mắc bệnh Gout.
Theo [20], acid Uric có pic oxi hóa ở + 0.389V. Tuy nhiên, trong điều kiện thực
nghiệm, pic oxi hóa của acid Uric có cường độ thấp, không ảnh hưởng đáng kể đến pic
oxi hóa của MLC nên chúng tôi vẫn xác định MLC trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân
3.2.12. ĐƯỜNG CHUẨN, GIỚI HẠN PHÁT HIỆN, GIỚI HẠN ĐỊNH
LƯỢNG
3.2.12.1 KHẢO SÁT ĐƯỜNG CHUẨN:
Dựa trên các thông số tối ưu đã chọn, tác giả tiến hành khảo sát đường chuẩn
với dung dịch chuẩn gốc Meloxicam từ 0.5 – 2.5 µg/ mL, kết quả thu được như trong
bảng 11, hình 15 và hình 16. Trong phương pháp Von – Ampe hấp phụ hòa tan, cường độ dòng phụ thuộc tuyến tính với nồng độ và dùng phương pháp đường chuẩn để định lượng.
Bảng 11: Giá trị cường độ pic đo được sử dụng để dựng đường chuẩn:
C (µg/ mL) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
I (µA) 2.4449 4.3880 6.4349 8.0551 9.5425
Hình 15. Đường chuẩn Meloxicam, tích góp 120s; 1 – pic MLC 0.5 µg/L, 2 - pic MLC 1.0 µg/L , 3- pic MLC 1.5 µg/L, 4- pic ML 2.0 µg/L, 5- pic MLC 2.5 µg/L.
Đường chuẩn MLC y = 3.5724x + 0.8144 R2 = 0.9955 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 0 1 2 3 C MLC (ug/ml) I(uA)
Hình 16. Đường chuẩn MLC, thời gian tích góp 120s, điện cực glassy carbon hoạt hóa.
3.2.12.2.GIỚI HẠN PHÁT HIỆN, GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG
Chúng tôi xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của
phương pháp (LOQ) dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính như trong phần phụ lục
đã đề cập. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng12: giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp:
Phương trình hồi quy LOD LOQ
y = 3.57x + 0.81 0.109 µg/mL 0.363 µg/mL
Nhận xét: Vậy với phương pháp hấp phụ hòa tan trên điện cực GC hoạt hóa
anod, có giới hạn phát hiện là: 0.109 µg/mL, giới hạn định lượng là 0.363µg/mL .
Khảo sát hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu: mẫu Mebilax 7.5 mg của
dược Hậu Giang làm nền và lần lượt thêm chất chuẩn MLC vào trước khi xử lý mẫu.
Tiến hành hòa tan, lọc qua giấy lọc rồi định mức dung dịch 10 mL với DMF. Sau đó
thông số tối ưu đã lựa chọn. Trong quá trình phân tích, đo từng nồng độ 03 lần để tính
độ lệch chuẩn tương đối, kết quả như bảng 13 và hình 17:
Bảng 13: Hiệu suất thu hồi và RSD của MLC.
Stt MLC thêm chuẩn
(µg/mL)
MLC thu hồi (µg/mL) Hiệu suất thu
hồi (%) % RSD (%) 1 Nền ( I = 2.28 µA ) 2 0.300 0.2926 ( I = 3.16 µA) 97.5 5.611 3 0.500 0.4742 (I = 3.84µA ) 94.9 3.961 4 1.000 0.9077 (I = 5.39µA ) 90.8 2.007 5 1.500 1.4932 (I = 7.48 µA) 99.5 2.592
Đường thêm chuẩn trên nền mẫu Mebilax - DHG y = 3.448x + 0.8551 R2 = 0.9947 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 0 0.5 1 1.5 2 C (ug/mL) I (uA)
Hình 17. Đường thêm chuẩn MLC trên nền mẫu Mebilax – DHG
1- nền mẫu Mebilax; 2, 3, 4, 5 – lần lượt thêm chuẩn MLC ở các nồng độ 0.3; 0.5; 1.0; 1.5 µg/mL trên nền mẫu Mebilax – DHG.
Nhận xét: Do quá trình xử lý mẫu không bị mất mẫu nên hiệu suất quy trình xử
lý mẫu đạt: 90.8 – 99.5%. Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%): 2.0 – 5.6 % < 10%
chứng tỏ phương pháp đề nghị cho độ lặp lại tốt. Có thể do bề mặt điện cực GC hoạt
hóa rất nhạy với MLC, hơn nữa chúng tôi rất chú trọng đến việc xử lý bề mặt điện cực.
3.2.12.3. KHẢO SÁT ĐƯỜNG THÊM CHUẨN, GIỚI HẠN PHÁT HIỆN, GIỚI
HẠN ĐỊNH LƯỢNG TRÊN MẪU NƯỚC TIỂU:
Dựa trên các thông số tối ưu đã chọn, tiến hành khảo sát đường thêm chuẩn trên
nền mẫu nước tiểu với dung dịch chuẩn gốc Meloxicam từ 5 – 30 µg/ mL. Chúng tôi
dùng phương pháp thêm chuẩn để định lượng MLC trong mẫu nước tiểu, kết quả như
trong bảng 14, 15 và hình 18:
Bảng14: Giá trị cường độ pic đo được khi khảo sát đường thêm chuẩn MLC trên nền mẫu nước tiểu:
C (µg/ mL) 10 15 20 25 30 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
I (µA) 4.5919 5.0039 5.5237 5.7741 6.3565
Đường thêm chuẩn MLC trên nền mẫu nước tiểu
y = 0.086x + 3.7303 R2 = 0.9898 3.0000 3.5000 4.0000 4.5000 5.0000 5.5000 6.0000 6.5000 7.0000 10 15 20 25 30
Nồng độ MLC thêm chuẩn (ug/m L)
Hình 18. Đường thêm chuẩn MLC trên nền mẫu nước tiểu
1, 2, 3, 4, 5 – lần lượt thêm chuẩn MLC ở các nồng độ 10; 15; 20; 25; 30 µg/mL trên nền mẫu nước tiểu
Bảng15: giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp thêm chuẩn
trên nền mẫu nước tiểu:
Phương trình hồi quy LOD LOQ
y = 0.0860x + 3.73 1.659 µg/mL 5.530 µg/mL
Từ quá trình khảo sát các đặc điểm của phương pháp, lập đường chuẩn, đường
thêm chuẩn và xác định LOD, LOQ; chúng tôi có cơ sở để ứng dụng vào thực tế xác
Chương 4 : PHÂN TÍCH MẪU MELOXICAM
4.1. PHÂN TÍCH MẪU MELOXICAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM:
4.1.1. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU DƯỢC PHẨM
4.1.1.1. XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PHỔ UV:
Trong đề tài này chúng tôi chọn phương pháp phổ UV là phương pháp đối chiếu
với phương pháp Von – Ampe. Quy trình như sau:
Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình từng viên, nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lượng bột viên ứng với 7.5 mg MLC vào bình định mức 100
mL. Thêm khoảng 60 mL acid Hydrocloric 0.1 N trong Methanol, lắc kỹ, sau đó thêm dung dịch vừa đủ, lắc đều. Lọc bỏ khoảng 30 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 3.0 mL dịch lọc cho vào bình mức 25 mL. Sau đó, thêm dung dịch đệm Phosphate pH 7.5 vừa đủ, trộn đều.
Đo độ hấp thu của dung dịch thử và dung dịch chuẩn ở bước sóng 362 nm với
mẫu trắng là dung dịch đệm Phosphate pH 7.5.
4.1.1.2 XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO, ĐẦU DÒ UV – VIS (RP - HPLC – UV/
VIS):
Lấy khối lượng thuốc chính xác pha loãng trong Metanol. Lọc, đánh siêu âm 1 giờ để hòa tan hoàn toàn và đuổi khí. Lọc và thêm dung dịch chuẩn vào mẫu với nồng độ mong muốn. Tiêm vào cột và tiến hành với điều kiện như trên.
4.1.1.3. XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON AMPE DÙNG GCE:
Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình từng viên, nghiền thành bột
mịn. Lấy phần khối lượng chính xác của mẫu có chứa khoảng 7.5 mg MLC (khoảng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
170 – 280 mg trong một viên) chuyển vào becher chứa 8 mL DMF và đánh siêu âm
khoảng 15 phút. Dung dịch được lọc vào bình định mức 10 mL, rửa với phần nhỏ
4.1.2. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU DƯỢC PHẨM:
Đánh sạch bề mặt điện cực bằng bột kim cương, thiết lập hệ ba điện cực. Hoạt hóa anod trong 50 mL đệm Phosphate 0.2M (pH 6.0) ở +1.8 V trong 240s. Quét thế
tuần hoàn từ - 0.8V đến + 1.0V (khoảng 10 vòng). Chuyển mẫu vào cell đo. Tích góp
MLC 120 s trên bề mặt điện cực GC hoạt hóa anod được thực hiện bằng cách khuấy
trong khoảng thế 0.00 V – 0.01 V. Thời gian cân bằng 15 s, tiến hành quét thế hòa tan từ 0.3V đến 0.7 V (so với SCE), tốc độ quét thế 10 mV/s. Thể tích cell đo 50 mL. Dùng micropipet hút 100 µL mẫu.
4.1.2.1 MẪU MEBILAX 7.5mg – DƯỢC HẬU GIANG - VIỆT NAM:
Đây là loại thuốc được dùng nhiều trên thị trường, tác giả chọn phân tích trên
hai phương pháp: Von – Ampe điện cực GC hoạt hóa và phổ UV: * Phương pháp phổ UV cho kết quả:
Phổ UV của Meloxicam:
Hình 19. Phổ UV của MLC 7.5mg
- Đường chuẩn:
Giá trị độ hấp thu đo được khi khảo sát đường chuẩn như trong bảng 16 và hình 20:
Bảng 16. Giá trị độ hấp thu đo được khi khảo sát đường chuẩn:
C MLC ( µg/ml) 5 8 10 15 20 25 30
Abs 0.348 0.556 0.699 1.054 1.407 1.761 2.090
Đường chuẩn MLC, phổ UV, BS 362 nm
y = 0.0701x - 0.0006 R2 = 0.9999 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 0 10 20 30 40 Nồng độ MLC ( ug/ml) Abs
Hình 20. Đường chuẩn MLC đo ở bước sóng 362 nm.
- Hàm lượng:
Thực hiện trên 03 mẫu, mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình. Cân 20 viên thuốc Mebilax 7.5 mg: m20 = 3923.2 mg
khối lượng trung bình một viên m tb1 = 196.16 0.01 mg.
Sau khi xử lý mẫu xong, đo độ hấp thu của dung dịch thử và dung dịch chuẩn ở bước sóng 362 nm với mẫu trắng là dung dịch đệm Phosphate pH 7.5, ghi nhận kết quả