ammonium (NH4NO3) để nuôi trồng các chủng tảo. Theo đó hàm lượng nguồn ure và ammonium tương ứng để đảm bảo hàm lượng N là:
Nguồn urea: 26,5 mg/l
Nguồn ammonium: 35,2 mg/l
2.4.1.2. Điều kiện nuôi cấy
Chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, chu kỳ chiếu sáng của phòng nuôi là 12 giờ sáng: 12 giờ tối. Nhiệt độ được điều chỉnh bằng máy điều hòa nhiệt độ từ 220C -250C .
2.4.1.3. Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy
- Xác định độ pH của môi trường nuôi cấy bằng máy đo pH hiệu Sension 3 - HACH ở Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế.
- Xác định độ mặn của môi trường nuôi cấy bằng máy đo độ mặn hiệu Horiba U52-Japan ở Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế.
- Thực hiện sục khí vào môi trường nuôi cấy bằng máy sục khí hiệu Winner. Aquarium W=9968.
- Đo cường độ ánh sáng môi trường nuôi cấy bằng Lux kế.
2.4.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Mật độ tế bào để xây dựng đường cong được xác định bằng phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Sedgewick Rafter (dung tích 1 mL với 1000 ô đếm) và kính hiển vi có độ phóng đại x10.
Cách đếm: đếm số lượng tế bào của 5 góc (4 góc ngoài cùng và 1 góc ở giữa), mỗi góc 10 ô. Tiến hành đếm số lượng tế bào ở độ phóng đại x10.
Cách tính: Mật độ tế bào (tế bào/mL) = F D A C . . 1000 . Trong đó:
C: Số lượng tế bào đếm được A: Diện tích của mỗi ô (1 mm2) D: Chiều cao mỗi ô (1 mm) F: Số lượng ô được đếm.
2.4.3. Nhân sinh khối
Từ các chủng phân lập được, kiểm tra sự tạp nhiễm. Khi mẫu là sạch, tiến hành nhân giống vào các chai 500 mL. Chuẩn bị môi trường nuôi, tiến hành nuôi trong thùng xốp (15 L hoặc 50 L) có sục khí. Tỉ lệ tiếp giống khoảng 10% (v/v) khi các tế bào đang ở pha sinh trưởng. Theo dõi sinh trưởng của chủng hàng ngày. Sinh khối thu ở cuối pha sinh trưởng bằng cách để lắng và ly tâm.
2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số
Lipid được tách chiết bằng phương pháp Soxhlet. Nguyên tắc
Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo như sắc tố, vitamin tan trong chất béo, chất mùi, … tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp.
Dụng cụ, hoá chất: - Bếp cách thuỷ - Tủ sấy
- Cân
- Chloroform, Methanol
- Bộ Soxhlet (gồm bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn). Tiến hành:
-Sấy khô nguyên liệu ở 1050C trong 2 giờ để làm bất hoạt các enzyme, sau đó sấy 650C đến khối lượng không đổi.
-Sấy giấy lọc đến khối lượng không đổi. Gói mẫu vào giấy lọc. -Chiết mẫu với hệ dung môi Chloroform: Methanol = 2:1(v/v).
-Điều chỉnh nhiệt độ để chu kì hoàn lưu của dung môi đạt từ 5 đến 8 lần trong một giờ. Chiết đến khi trích ly hoàn toàn chất béo.
-Sau khi chiết xong, sấy túi mẫu 65oC đến khối lượng không đổi, xác định khối lượng.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Tính toán kết quả:
1 2 1 ).100 ( m m m x= − Trong đó:
x: hàm lượng lipid (% khối lượng khô) trong mẫu m1: khối lượng mẫu khô ban đầu (g)
m2: khối lượng mẫu khô sau khi chiết (g)
2.4.5. Bố trí thí nghiệm
2.4.5.1. Thiết lập đường cong sinh trưởng
Phân phối môi trường F/2 vào chai thủy tinh dung tích 100 mL, mỗi chai 50 mL. Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v). Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phòng cấy vô trùng.
Ghi thời gian chuyển mẫu. Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, … 12, 14 ngày nuôi cấy. Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
2.4.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitrogen kết hợp với điều kiện ánh sáng đến sinh trưởng của các chủng tảo được thực hiện trên cơ sở hàm lượng nitơ có trong môi trường nuôi F/2 (12,35 mg N/l) . Nguồn nitrogen được sử dụng cho nghiên cứu này ở dạng NaNO3.
Mỗi chủng chuẩn bị hai lô thí nghiệm với 5 môi trường: - Môi trường đối chứng: sử dụng NaNO3 7,5g/100ml - Môi trường giảm 50% N: sử dụng NaNO3 3,75g/100ml - Môi trường giảm 100% N: loại NaNO3 khỏi F/2
- Môi trường tăng 50% N: sử dụng NaNO3 11,25g/100ml - Môi trường tăng 100% N: sử dụng NaNO3 15g/100ml
Phân phối môi trường vào các chai tam giác dung tích 250 mL, mỗi chai 100 mL môi trường. Cấy giống với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v). Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phòng cấy vô trùng.
Ghi thời gian chuyển mẫu. Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, … 12, 14 ngày nuôi cấy. Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
Một lô bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 12h sáng: 12h tối (12h:12h), còn một lô kia bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 6 ngày sáng: 6 ngày tối (6d:6d).
Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau đến sinh trưởng của các chủng nghiên cứu ở dạng nirtrat, ammoni, urea. Tiến hành khảo sát sự sinh trưởng trong chai kín dung tích 250mL, mỗi chai 100 mL môi trường. Cấy giống
với mật độ tiếp giống ban đầu như nhau, tỉ lệ khoảng 10% (v/v). Thực hiện thao tác chuyển mẫu trong phòng cấy vô trùng.
Ghi thời gian chuyển mẫu. Lấy mẫu để xác định mật độ tế bào sau 2, 4, … 12, 14 ngày nuôi cấy. Tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp lại.
2.4.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến tích lũy lipid ở các chủng nghiên cứu
Nhân giống cấp 1 của mỗi chủng nghiên cứu trong chai thủy tinh 500mL. Nhân giống cấp 2 trong thùng xốp: Mỗi chủng chuẩn bị môi trường thí nghiệm giống mục 2.4.5.2 nhưng với chai dung tích 500mL, mỗi chai 500mL môi trường, hấp khử trùng môi trường. Giống được nuôi ở điều kiện đầy đủ dinh dưỡng đến cuối pha sinh trưởng, sau đó chuyển nhân sinh khối với các môi trường nêu trên với tỉ lệ 1 giống: 5 môi trường (v/v). Khử trùng thùng xốp bằng cồn 90o, cho mỗi loại môi trường vào mỗi thùng cùng với giống cấp 1, thao tác trong phòng nuôi vô trùng.
Nuôi cấy trong thời gian 12 ngày, tiến hành thu sinh khối và chiết lipid. Bố trí các công thức thí nghiệm theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bố trí công thức thí nghiệm ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường và chiếu sáng đến hàm lượng lipid
Điều kiện ánh sáng Điều kiện môi trường Tên công thức thí nghiệm
12h: 12h (-)50% N I (-)100% N II (+)50% N III (+)100% N IV Ammonium V Urea VI 6d: 6d (-)50% N VII (-)100% N VIII (+)50% N IX (+)100% N X 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết lập đường cong sinh trưởng
Mỗi chủng tảo silic có tốc độ sinh trưởng khác nhau nên việc xây dựng đường cong sinh trưởng cho mỗi chủng có vai trò quan trọng trong nghiên cứu. Đường cong sinh trưởng là cơ sở để xác định thời gian cấy chuyển, tiếp giống cũng như thời điểm thu sinh khối thích hợp.
Để xác định đường cong sinh trưởng của các hủng nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy trong môi trường F/2 trong các chai dung tích 100 mL, mỗi chai 50 mL môi trường dinh dưỡng. Mật độ tế bào được xác định sau mỗi 2, 4, 6,…, 14 ngày nuôi cấy. Đường cong sinh trưởng được vẽ ra dựa vào sự biến động mật độ tế bào sau một thời gian nuôi cấy. Kết quả xác định mật độ tế bào được trình bày ở bảng 3.1 và đường cong sinh trưởng được minh họa ở hình 3.1
Bảng 3.1 . Mật độ tế bào của các chủng tảo qua các thời gian nuôi cấy
Mật độ tế bào(x104 tb/mL)
Chủng Thời gian (ngày)
0 2 4 6 8 10 12 14
PLTA 0,12 0,2 0,81 1,08 1,23 1,44 1,57 1,29
Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng PLTA và NITA
Kết quả cho thấy, 2 chủng nghiên cứu đều phát triển cực đại từ 10-12 ngày, sau đó đi vào pha tử vong:
- Chủng PLTA sinh trưởng tối đa vào khoảng ngày thứ 12 và có pha tử vong diễn ra chậm. Mật độ tế bào cực đại vào ngày thứ 12 của chủng PLTA là 1,57 x 104
tế bào/mL, cao gấp khoảng 13 lần số tế bào ban đầu.
- Chủng NITA có mật độ tế bào gia tăng nhanh vào khoảng ngày thứ 10 và đạt cực đại ở ngày thứ 12 với 3,97 x 104 tế bào/mL, cao gấp khoảng 9 lần số tế bào ban đầu sau đó đi vào pha tử vong và mật độ suy giảm dần.
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG PLTA VÀ NITA
Hình 3.2. Hình ảnh thí nghiệm nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng tảo trên các điều kiện môi trường khác nhau.1. PLTA (12h:12h), 2.PLTA (6d:6d),
3. NITA (12h:12h), 4. NITA (6h:6h).
Nitrogen (N) chất dinh dưỡng quan trọng cho sự tăng trưởng và trao đổi chất của các tế bào tảo. N là một yếu tố cơ bản cho sự hình thành các protein và acid nucleic, cấu tạo nên các phân tử ATP, đơn vị năng lượng trong các tế bào, nó cũng là một thành phần thiết yếu của tất cả các protein cấu trúc và chức năng trong tế bào tảo, chiếm 7 % -20% trọng lượng khô tế bào. Tảo hấp thụ N vô cơ rồi nhanh chóng đồng hóa thành các hợp chất sinh hóa nhằm đáp ứng thay đổi nhu cầu sinh lý của tế bào [].
Có nhiều nghiên cứu cho rằng thành phần tế bào vi tảo có thể chịu ảnh hưởng bởi một hóa chất hay yếu tố vật lý riêng biệt, nhưng hiệu quả của tác động như vậy thường không cao, và sự thay đổi thường là thấp. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của hai điều kiện ánh sáng và hàm lượng nitrogen đến sự sinh trưởng của các chủng tảo nhằm tìm ra điều kiện mà ở đó chúng tăng trưởng tốt nhất. Chuẩn bị môi trường với giá trị pH, độ mặn tối ưu, trong đó thay đổi hàm lượng dinh dưỡng N. Phân phối môi trường vào các chai tam giác thủy tinh dung tích 250 mL, mỗi chai 100 mL. Giống được nuôi ở điều kiện đầy đủ dinh dưỡng đến cuối pha sinh trưởng, sau đó chuyển qua các môi trường nêu
1 2
trên với tỉ lệ tiếp giống như nhau, khoảng 10% (v/v). Kết quả được trình bày ở bảng hình 3.3 và hình 3.4
A
B
Hình 3.3 . Khả năng sinh trưởng của PLTA ở các điều kiện môi trường khác nhau
A. Điều kiện chiếu sáng 12h: 12h B. Điều kiện chiếu sáng 6d: 6d
A
B
Hình 3.4 . Khả năng sinh trưởng của NITA ở các điều kiện môi trường khác nhau A.Điều kiện chiếu sáng 12h: 12h
B. Điều kiện chiếu sáng 6d: 6d
Kết quả nghiên cứu cho thấy các mức N khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng của các chủng tảo. Tuy nhiên sự sinh trưởng của chúng ở các môi trường này đều kém hơn so với môi trường đối chứng, đồng thời khả năng sinh trưởng ở các điều kiện khác nhau là khác nhau. Hầu hết các môi trường, sinh khối cực đại đều đạt được ở ngày nuôi thứ 12 và ngày 14 đối với (-)100% N. Ở điều kiện
(-)100% N luôn làm cho các chủng tảo sinh trưởng kém nhất. Trong đó, tảo được nuôi ở các mức N cao hơn, cho sinh khối cực đại lớn hơn.
- Đối với chủng PLTA (12h:12h): Mật độ tế bào đạt 1,74 x 104 tế bào/mL đối với (+)100% N; 1,89 x 104 tế bào/mL đối với (+)50% N; 1,57 x 104 tế bào/mL đối với đối chứng) so với các mức N thấp hơn (1,36 x 104 tế bào/mL đối với (-)50% N, 0,64 x 104 tế bào/mL đối với (-)100% N.
- Đối với chủng NITA (12h:12h): Không có sự khác biệt ở mức (+)100% N: Mật độ tế bào đạt 5,21 x 104 tế bào/mL và (+)50% N: 5,29 x 104 tế bào/mL (3,96 x 104 tế bào/mL đối với đối chứng), với các mức N thấp hơn (2,34 x 104 tế bào/mL đối với (-)50%N, 1,14 x 104 tế bào/mL đối với (-)100%N.
Có thể nhận thấy một xu hướng chung rằng, khi gia tăng mức N từ (+)50% N đến (+)100% N, sinh khối cực đại đạt được của tảo (vào ngày nuôi thứ 12) có xu hướng giảm. Ngược lại, ở nhóm thấp hơn (tảo được nuôi ở mức N thấp hơn mức N đối chứng) cho sinh khối cực đại tăng dần từ (-)100% N đến (-)50% N.
Các mức N khác nhau ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của tảo đề cập trong nhiều nghiên cứu. Dư thừa hay thiếu hụt N đều làm giảm sinh trưởng, khả năng trao đổi chất, chất lượng dinh dưỡng của nhiều loài tảo trong đó có tảo silic. Trong nghiên cứu này, khi mức N cao hoặc thấp hơn giá trị tối ưu (+)50% N đối với chủng PLTA và (+)50% N, (+)100% N đối với chủng NITA, quá trình quang hợp của tảo vẫn diễn ra nhưng với cường độ thấp, sinh khối tảo gia tăng chậm.
Bên cạnh đó, điều kiện chiếu sáng cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng tảo. Hai lô thí nghiệm bố trí ở hai điều kiện ánh sáng có sự khác biệt rõ rệt. Lô thí nghiệm bố trí ở điều kiện chiếu sáng 12h:12h tăng trưởng theo cấp lũy thừa. Còn lô bố trí ở điều kiện 6d:6d thì trong 6 ngày đầu được chiếu sáng, tốc độ sinh trưởng xảy ra nhanh hơn, tuy nhiên khi bước vào giai đoạn ủ tối thì sinh khối không tăng nữa.
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng của PLTA ở các nguồn N khác nhau
Ngày Mật độ tế bào (x104 tế bào/mL)
Môi trường
Nitrat Ammonium Urea
0 0,17 0,17 0,18 2 0,41 0,28 0,43 4 0,71 0,44 0,67 6 0,95 0,79 0,74 8 1,04 0,82 0,77 10 1,29 1,13 1,26 12 1,64 1,31 1,59 14 1,43 0,97 1,18
Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng của NITA ở các nguồn N khác nhau
Ngày Mật độ tế bào (x104 tế bào/mL)
Môi trường
Nitrate Urea Ammonium
0 0,45 0,49 0,49 2 0,77 0,84 0,51 4 1,07 1,13 0,98 6 3,05 3,38 2,18 8 3,27 4,16 3,09 10 3,33 4,44 3,89 12 3,97 4,97 3,86 14 2,74 3,04 2,4
Sau carbon, nitrogen (N) là chất dinh dưỡng quan trọng góp phần vào sự sản xuất sinh khối của vi tảo. Nitrogen được cung cấp chủ yếu như nitrat nhưng ammonium và urea cũng được sử dụng. Một số hợp chất nitrogen hữu cơ (hypoxanthine, lysine, guanine…) cũng được sử dụng bởi tảo [].
Võ Hồng Trung, Lê Thị Trung (2012) đã nuôi cấy Chaetoceros subtilis trên môi trường có bổ sung N-ammonium cho thấy ở nồng độ 75 µmol/L tế bào vi tảo đạt được sự sinh trưởng và sinh lý tốt nhất [].
Từ kết quả trên ta thấy, trong các điều kiện trên thì môi trường nitrate có ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng PLTA nhất, mật độ tế bào đạt cao nhất là 1,64 x 104 tế bào/mL ở ngày thứ 12; tiếp đến là môi trường urea với mật độ tế bào 1,59 x 104 tế bào/mL; ở môi trường ammonium chủng sinh trưởng kém nhất chỉ đạt 1,31 x 104 tế bào/mL. Đối với chủng NITA sự sinh trưởng của chủng tảo không có sự khác biệt đáng kể giữa môi trường ammonium (3,86 x 104 tế bào/mL) và môi trường nitrate (3,97 x 104 tế bào/mL) và mật độ tế bào đạt cao nhất là môi trường urea với 4,97 x 104 tế bào/mL. Ammonium cũng là nguồn nitrogen ưa thích đối với vi sinh vật và sự sự đồng hoá nitrat hoặc ammonium đều liên quan đến môi trường. Khi ammonium được sử dụng như là nguồn nitrogen duy nhất, pH có thể giảm đáng kể trong giai đoạn tăng trưởng mạnh, do sự giải phóng các ion H+. Ngược lại, pH tăng khi nitrat được cung cấp như nguồn nitrogen duy nhất [].
Hình 3.7. Hình ảnh nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng tảo silic trên các điều kiện môi trường khác nhau: PLTA (trái), NITA (phải).
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN TÍCH LŨY LIPID Ở CHỦNG PLTA VÀ NITA