V. Biểu hiện gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA
2.8Phương pháp điện di trên gel agarose
4. Phương pháp nghiên cứu
2.8Phương pháp điện di trên gel agarose
* Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng
đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyÓn về phía cực dương của điện trường. TÝnh linh động của phân tử này phụ thuộc vào 2 chỉ tiêu là trọng lượng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel:
- Trọng lượng phân tử: các DNA có kích thước lớn sẽ chuyển động chậm trong gel agrose còn DNA có kích thước nhỏ sẽ chạy nhanh hơn. Các DNA ở dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn DNA ở dạng thẳng. - Nồng độ các chất cấu thành gel: đoạn gen càng nhỏ thì nồng độ agarose 1% càng phải tăng lên để phát hiện các đoạn gen nhỏ tới nucleotide.
* Phương pháp đổ gel
Đun gel agrose 1%, để cho gel nguội đến khoảng 50 – 600
C.
Đổ gel vào khuôn có cài sẵn răng lược cho gel đông lại.
Nhấc lược ra, đặt bản gel vào bể điện di.
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di.
Trộn mẫu cần điện di với Loading Dye và tra vào giếng. Dung dịch
đệm Loading Dye có tác dụng làm tăng trong lượng riêng của acid nucleic, vì vậy nó sẽ kéo phân tử acid lắng xuống đáy giếng.
Tiến hành chạy điện di ở 100V. Quan sát khi mẫu chạy đươc 2/3 bản gel thì tắt máy, nhấc bản gel ra và nhuộm trong dung dịch Ethidium Bromide khoảng 5 phót, vít gel ra rửa qua nước và đặt lên máy soi gel để quan sát các băng DNA hoặc chụp ảnh.
Quá trình điện di dài hay ngắn còn phụ thuộc vào điện thế của thiết bị, nếu điện thế ổn định thì sau 30 – 40 phót sẽ điện di xong.
Thuốc nhuộm Ethydium Bromide có tác dụng phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại giúp cho việc hiện hình các băng rõ ràng hơn.