trùng
1. Chuyển gen vào tinh trùng
Tinh trùng trưởng thành có genome bất hoạt không có khả năng tái bản. DNA của nó được bao phủ bởi protamine làm cho DNA ngoại lai rất khó đi vào trong genome tinh trùng. Vì vậy DNA ngoại lai không có cơ hội để hợp nhất vào DNA tinh trùng.
Các thí nghiệm thực hiện cách đây khoảng gần một thập kỷ cho thấy rằng tinh trùng ủ với DNA có thể mang DNA đến trứng trong quá trình thụ tinh dẫn đến kết quả là tạo ra chuột chuyển gen. Các nghiên cứu hóa sinh học cho thấy DNA bám vào tinh trùng một cách dễ dàng nhưng không chứng minh được rằng điều này xảy ra do sự xâm nhập của DNA. Vì thế tinh trùng đóng vai trò là một thể truyền đối với DNA ngoại lai.
Sau một vài năm, phương pháp này được áp dụng rộng rãi với bò, lợn, cừu và cá medaka (Hình 2.24). Trong tất cả các trường hợp này không hiểu tại sao các thí nghiệm rất khó thành công. Hơn nữa, phần lớn các trường hợp, DNA ngoại lai hợp nhất vào genome vật chủ đã được sắp xếp lại ở mức độ cao. Một nghiên cứu đã cho thấy rằng ngay cả sau khi đã rửa cẩn thận, tinh trùng chứa DNAse đã phân hủy DNA ngoại lai. DNAse có rất nhiều trong nguyên sinh chất của tinh trùng và lượng enzyme này bám vào tinh trùng là thay đổi đã giải thích tại sao thí nghiệm này không thành công và tại sao DNA ngoại lai bị phân cắt. DNA ngoại sinh dường như gây ra hoạt tính DNAse ở tinh trùng đã tách chiết ra. Có thể giải thích hiện tượng này là DNAse một phương tiện để bảo vệ tinh trùng tránh khỏi sự nhiễm DNA ngoại sinh trên đường từ mào tinh hoàn đến tế bào trứng (Baccetti và Spadafora, 2000).
Các thử nghiệm để tăng DNA xâm nhập vào tinh trùng đã được thực hiện. Sự xung điện hoặc chuyển nhiễm với các tác nhân hóa học đã làm tăng sự hấp thu DNA vào tinh trùng. Hiện tượng này thường được kèm theo do khả năng thụ tinh cho bào trứng của tinh trùng.
Ở Xenopus, chuyển gen vào phôi bằng vi tiêm dẫn đến sự biểu hiện của gen ngoại lai và nó tồn tại từ vài ngày đến vài tuần nhưng lại không hợp nhất vào genome vật chủ. Ðể khắc phục khó
Hình 2.24: Chuyển gen vào tinh trùng
A.Tinh trùng đã rửa ủ với DNA được sử dụng để thụ tinh in vivo
hoặc in vitro. Phương pháp này không có hiệu quả đặc hiệu đối với việc tạo động vật chuyển gen và các gen đã hợp nhất thường bất hoạt do sự sắp xếp lại DNA
B.Màng tinh trùng bị tổn thương bởi chất tẩy nhẹ. DNA ngoại lai đi vào tinh trùng một cách tự do. Các tinh trùng này được sử dụng để thụ tinh in vitro bằng phương pháp ICSI
khăn này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng tinh trùng làm thể mang (carrier). Protocol đã được xác định sớm hơn cho động vật có vú đã chứng tỏ không hiệu quả ở Xeponus. Ðể tăng khả năng hấp thu DNA, tinh trùng được xử lý với Triton, một chất tẩy nhẹ. Ðiều này dẫn đến sự không ổn định của màng tinh trùng làm cho DNA tự do đi vào tinh trùng. Kết quả tương tự cũng đạt được khi làm lạnh và ấm tinh trùng. Chromatin đã bị phân hủy do enzyme hạn chế nhận biết một vài vị trí ở chromatin của tinh trùng nhưng đối với DNA ngoại lai thì không xảy ra. Ðiều này gây ra cơ chế sửa chữa và làm tăng cơ hội hợp nhất DNA ngoại lai vào genome của phôi. Phương
pháp này có tên gọi là REMI (restriction enzyme mediated intergration=sự hợp nhất qua trung gian ezyme hạn chế), một phương pháp làm tăng sự biến nạp của tế bào. Sau các xử lý này, tinh trùng mất khả năng thụ tinh cho trứng. Tiêm trực tiếp tinh trùng vào trứng (intra-cytoplasmic sperm ịnjection=ICSI) được sử dụng đối với sự thụ tinh in vitro ở người. Phương pháp này đã được áp dụng cho Xeponus và đã tạo ra Xeponus chuyển gen với kết quả có thể chấp nhận (Hình 2.12B). Ðặc biệt hiện nay các nhà sinh học đã ứng dụng chuyển gen vào loài này để nghiên cứu sự phát triển (Marrsh-Arrmstrong, 1999; Perrny, 2001).
Phương pháp này, trước tiên được sử dụng cho Xeponus, đã chứng tỏ thành công ở chuột. Tuy nhiên nó không cho kết quả cao hơn phương pháp vi tiêm vào tiền nhân là một phương pháp đơn giản hơn nhiều. Phương pháp ISCI đã được sử dụng thành công hoàn toàn ở chuột khi chuyển các đoạn DNA dài được thiết kế trong các vector BAC và YAC (Perry, 2001). Vì vậy phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi đối với các loài khác kể cả gia súc lớn. Hiện nay hạn chế của việc sử dụng ICSI ở các loài này là khó khăn. Dường như là không thể áp dụng với các loài không thuộc bộ Linh trưởng mà việc chuyển gen là khó khi sử dụng các phương pháp khác.
Gần đây, một phương pháp tuyệt vời đã được đề xuất (Qian, 2001). DNA bám vào kháng thể đơn dòng nhận biết một protein trên bề mặt tinh trùng hình thành nên một phức hợp ổn định với tinh trùng. Phương pháp này đã được sử dụng để thụ tinh in vitro ở chuột, gà bằng thụ tinh nhân tạo và lợn bằng cách tiêm vào sừng tử cung. Trong ba trường hợp này, khoảng 30% cá thể con sinh ra là động vật chuyển gen. Gen chuyển đã không bị sắp xếp lại. Nó đã biểu hiện và truyền lại cho thế hệ sau. Ðiều quan tâm là kháng thể đơn dòng giống nhau nhận biết tinh trùng của động vật có xương sống thấp hơn và cao hơn kể cả con người. Phương pháp này có thể được dùng để tạo Linh trưởng chuyển gen.
2. Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro
Tinh trùng thành thục được tạo ra từ các tế bào gốc thông qua các giai đoạn khác nhau của sự biệt hóa (Hình 2.25). Các tế bào gốc
tinh trùng có thể được tách chiết, nuôi cấy in vitro trong một thời gian ngắn và được cấy chuyển vào tinh hoàn nhận. Các tế bào cấy chuyển này hoạt động theo chương trình biệt hóa của chúng làm cho tinh trùng hoạt động chức năng. Tỉ lệ tinh trùng tạo thành từ các tế bào gốc cấy chuyển được tăng lên nhiều nhờ sự xử lý các con đực nhận với bisulfan. Bisulfan là một loại thuốc ngăn cản sự biệt hóa của tế bào gốc tinh hoàn. Protocol này đã được sử dụng một cách thành công để chuyển gen vào tế bào gốc trong quá trình nuôi cấy. Ðiều này đạt được nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu quả. Các tế bào gốc cấy chuyển vào con đực nhận đã xử lý bisulfan dẫn đến kết
Hình 2.25: Sử dụng các tế bào tiền thể của tinh trùng để chuyển gen
A. Các bước khác nhau của sự biệt hóa tế bào gốc thành tinh trùng
B.Các tế bào gốc hoặc các tế bào đã biệt hóa một cách cục bộ được tách chiết, nuôi cấy và chuyển DNA chọn lọc vào. Tinh trùng mang DNA ngoại lai này được sử dụng để thụ tinh bằng phương pháp ICSC
C.Tế bào gốc được tách chiết, nuôi cấy dưới những điều kiện ngăn cản sự biệt hóa của chúng, được chuyển DNA ngoại lai vào, được
chọn lọc và đưa vào lại một tinh hoàn nhận, nơi mà chúng biệt hóa. Tinh trùng tạo ra được sử dụng để thụ tinh trứng bằng phương pháp thông thường
quả là tạo ra chuột chuyển gen với tỉ lệ cao, khoảng 4%(Nagano, 2001). Phương pháp này là hữu dụng để nghiên cứu ảnh hưởng sinh học của gen trong quá trình thành thục tế bào gốc tinh trùng và để tạo động vật chuyển gen. Có thể suy ra phương pháp này ít thành công hơn đối với các loài lớn hơn chuột. Dường như cần thiết phải sử dụng các tế bào đã được biến nạp cao hơn để tăng cơ hội định cư ở tinh hoàn với một tỉ lệ chấp nhận được.
2.2. Chuyển gen vào tiền thể của tinh trùng in vivo
DNA liên kết với thể chuyển nhiễm có thể được tiêm vào các ống sinh tinh (Hình 2.26). Một số nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc tạo chuột chuyển gen bằng cách sử dụng tinh trùng của các động vật đã được xử lý (Sato, 2002). Những kết quả khích lệ này có hiệu quả vừa phải và hãy còn chưa đạt chuẩn. Hiện chúng đang được cải tiến nhưng chắc chắn là chưa có cách nào làm cho có thể áp dụng rộng rãi phương pháp này đối với các động vật lớn hơn chuột. Quả thực cấu trúc của các ống dẫn tinh khác nhau và việc tiêm DNA là khó. Mặt khác, lượng DNA tiêm vào có thể là rất lớn và khó điều khiển.
DNA bình thường hoặc DNA bám vào thể chuyển nhiễm được tiêm trực tiếp vào các ống sinh tinh. Các tế bào đã hợp nhất DNA ngoại lai sẽ tạo ra động vật chuyển gen sau khi thụ tinh bình thường
Một điểm khác cũng cần được nghiên cứu. Ðó là ở chuột, gen chuyển vào tiền thể của tinh trùng in vivo xảy ra một cách độc lập trong các tế bào khác nhau dẫn đến tạo ra các động vật sơ sinh có sự hợp nhất khác nhau. Ðây là một thuận lợi vì sự hợp nhất khác nhau có thể cho các kiểu hình hơi khác biệt. Với phương pháp này, các nhà nghiên cứu có thể đánh giá các dòng động vật chuyển gen phức tạp từ một thí nghiệm đơn giản.