C vs vật: mua tại ngân hàng AT gồm Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis AT 2
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Thu thập và phân loại rong biển
Hai mẫu rong thu thập Ďược bao gồm:
Rong nâu Sargassum henslowianum dùng Ďể chiết fucoidan, thu hái ở bán Ďảo Sơn Trà – Thừa Thiên Huế, tháng 8 năm 2011.
Rong nâu Sargassum swartzii dùng Ďể chiết alginate và fucoidan, thu hái ở vịnh Nha Trang – Khánh Hòa, tháng 3 năm 2011.
Các mẫu rong Ďược giám Ďịnh và xác Ďịnh tên khoa học bởi TS. Lê Như Hậu (Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang). Sau khi thu hái, mẫu Ďược rửa dưới vòi nước máy Ďể loại muối, cát và phơi trong bóng râm. Rong Ďược sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt Ďộ 40-50oC, cắt nhỏ. Rong khô Ďã cắt nhỏ Ďược nghiền thành bột và bảo quản ở nhiệt Ďộ phòng.
Sargassum henslowianum Sargassum swartzii
Hình 3.1. Hì ẫu r u
3.2. Xác định thành phần hóa học của rong
Cân 5g mẫu vào trong Ďĩa Ďáy bằng, Ďể qua Ďêm trong tủ sấy ở nhiệt Ďộ 100- 1100C và cân lại. Chênh lệch khối lượng trước và sau khi sấy Ďược Ďánh giá như một Ďơn vị Ďo hàm lượng Ďộ ẩm. Độ ẩm của rong Ďược tính theo công thức:
khối lượng mẫu trước sấy (g) - khối lượng sau sấy (g) % Ďộ ẩm = x 100
khối lượng mẫu trước khi sấy (g)
Ở mẫu rong nghiên cứu, chúng tôi xác Ďịnh Ďược Ďổ ẩm của rong là 8%. Phân tích hàm lượng tro, protein thô, chất béo thô theo AOAC [35].
Hàm lượng tro:
Cân 2g mẫu thử vào trong cốc nung bằng sứ và Ďặt vào trong lò nung, nâng dần nhiệt Ďộ lên 6000C. Giữ nhiệt Ďộ Ďó trong 2 giờ. Chuyển thẳng cốc nung vào bình làm khô, Ďể nguội, cân ngay và biểu diễn phần trăm tro ở vị trí số thập phân thứ nhất.
khối lượng mẫu thử (g) - khối lượng sau nung (g)
% (w/w) tro = x100 khối lượng mẫu thử (g)
Protein thô:
Protein thô Ďược xác Ďịnh bằng phương pháp micro Kjeldahl.
Cân chính xác khoảng 2g mẫu rong Ďem thử, cho vào bình cầu 100ml, cho thêm vào 30ml dung dịch H2SO4 Ďậm Ďặc, tiếp theo 10g K2SO4 và 1g CuSO4. Hỗn hợp này Ďược Ďun nhẹ cho Ďến khi hết sủi bọt thì Ďun tăng mạnh lên. Khi dung dịch chuyển thành không màu hoặc trong suốt, tiếp tục Ďun thêm 1 giờ nữa, Ďể nguội, pha loãng với nước cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800ml, rửa sạch bình phản ứng. Đưa vào bình 3 hoặc 4 hạt kẽm kim loại và 100ml dung dịch NaOH 40%. Bình Ďược nối với Ďầu phun của thiết bị chưng cất. Tiếp theo nhỏ 25ml dung dịch H2SO4 0,1N vào trong bình và tiến hành chưng cất. Khi hai phần ba lượng chất lỏng Ďã Ďược cất, kiểm tra xem phản ứng Ďã xảy ra hoàn toàn chưa. Bình thu Ďược lấy ra chuẩn Ďộ với dung dịch H2SO4 0,1N sử dụng chỉ thị methyl Ďỏ. Sau Ďó chuyển Ďổi về hàm lượng protein theo công thức:
Protein = Nitrogen x 6,25
Chất béo thô:
Cân 2g mẫu rong khô, chiết với n-hexan trong bình chiết Soxhlet, Ďun nóng bình trên bếp cát trong 6 giờ cho Ďến khi một giọt Ďược lấy từ bình nhỏ giọt không Ďể lại vết dầu trên giấy lọc. Sau khi Ďun với n-hexan, lọc dầu cặn bằng giấy lọc Whatman No.40 và dịch lọc Ďược cho bay hơi trong một cốc Ďã cân trước. Lượng khối lượng chênh giữa hai lần cân cốc cho ta biết khối lượng chất béo thô.
Hàm lượng laminaran Ďược xác Ďịnh bằng phương pháp của Zvyagintseva và cộng sự [144].
Trước hết thực hiện quá trình phân lập và tách phân Ďoạn laminaran. Quy trình Ďược thực hiện như sau:
Rong biển tươi Ďược chiết với ethanol, acetone, chloroform Ďể loại chất béo. Bã rong sau khi Ďã Ďược loại chất béo Ďược chiết với HCl 0,4% ở nhiệt Ďộ phòng thu Ďược dịch chiết, ly tâm, tách bã rong. Làm thêm 1 lần như vậy, gộp dịch chiết. Cho dịch chiết này chảy qua cột polyteflon, laminaran sẽ bị giữ lại trên cột. Rửa nước qua cột cho Ďến khi dịch chảy ra hết tạo tủa với hexadecyltrimethylamonibromide. Dùng EtOH 20% Ďể rửa giải laminaran, thêm ethanol (8 lần) Ďể kết tủa hết laminaran. Ly tâm loại ethanol, thêm acetone 2 lần, kết tủa Ďược sấy khô trong chân không, Ďây chính là lượng laminaran có trong rong.
Hàm lượng acid alginic Ďược xác Ďịnh bằng phương pháp Usov và cộng sự [129].
Mẫu rong sau khi Ďược loại chất màu và chất béo Ďược khuấy với dung dịch Na2CO3 nồng Ďộ 3% (25ml) trong vòng 1 giờ ở 700C, dịch chiết Ďược tách bằng ly tâm, và cặn Ďược xử lý lần hai dưới Ďiều kiện tương tự. Dịch chiết soda gộp lại Ďược xử lý ở nhiệt Ďộ phòng với 5 giọt bromide (Br-) (110mg; 0,035ml); khuấy một vài phút cho Ďến khi bromide tan hoàn toàn và giữ qua Ďêm. Dung dịch Ďã loại màu Ďược thẩm tách 3 ngày với nước cất chuyển vào trong bình thể tích 500ml, Ďưa về vạch bằng nước cất và lọc (nếu cần thiết) qua giấy lọc, hàm lượng acid alginic Ďược xác Ďịnh trong 0,5ml dung dịch mẫu bằng phản ứng so màu với 3,5-dimethylphenol
và acid sulfuric. Dung dịch natri alginate (100mg/l, BDH, UK) Ďược sử dụng Ďể vẽ Ďường chuẩn trong vùng 0-50 µg trên mẫu.
Hàm lượng lipid: lipid Ďược chiết xuất theo phương pháp Bligh và cộng sự [110].
Cân chính xác 2g rong khô, cho vào bình cầu 100ml. Thêm vào 20ml methanol và 10ml chloroform, lắc kỹ. Sau Ďó thêm 10ml chloroform, tiếp tục lắc kỹ rồi thêm 10ml nước cất, tiếp tục lắc mạnh, lọc bỏ bã. Dịch lọc Ďược ly tâm với tốc Ďộ quay 1.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt Ďộ phòng. Dịch sẽ Ďược tách thành hai pha, tách bỏ pha nước. Pha hữu cơ có chứa chất béo Ďược thêm 10ml NaOH 0,5M trong ethanol, Ďun cách thủy hồi lưu trong vòng 60 phút. Các acid béo sẽ Ďược biến Ďổi thành methyl este acid béo (FAMEs) và sau Ďó FAMEs Ďược xác Ďịnh bằng phương pháp GC-FID với chất chuẩn FAME của Merck.
3.3. Chiết tách các ionic polysaccharide
Việc chiết các polysaccharide từ rong biển không hoàn toàn giống như chiết các nguồn dược liệu khác. Tuỳ theo cách chiết (dung môi, nhiệt Ďộ, pH, thời gian chiết…) mà có thể thu Ďược các polysaccharide khác nhau [85].
Sau khi tham khảo các Ďiều kiện nghiên cứu mà các tác giả Ďã công bố. Chúng tôi Ďã khảo sát các quy trình sau Ďể tách chiết fucoidan và alginate từ các loại rong thu thập Ďược.
3.3.1. Chiết đồng thời fucoidan và alginate
Từ các mẫu rong thu thập Ďược, chúng tôi áp dụng quy trình chiết Ďể Ďồng thời thu nhận cùng lúc cả alginate và fucoidan. Quy trình cụ thể như trình bày trong Sơ Ďồ 3.1.
Sơ đồ 3.1. Quy trì ết t đồ t ờ alginate và fucoidan
Rong biển (100g) Ďược loại chất béo lần lượt với 500ml ethanol, 500ml acetone và 400ml chloroform ở nhiệt Ďộ phòng. Rong sau khi Ďã Ďược loại chất béo Ďược khuấy lần thứ nhất với 500ml HCl 0,4M ở nhiệt Ďộ phòng, lọc, thu Ďược dịch chiết 1. Bã tiếp tục Ďược chiết với nước nóng ở 60-70oC, lọc thu Ďược dịch chiết 2. Dịch chiết 1 và 2 này Ďược cho chạy qua cột teflon (7cm x 70cm), rửa giải bằng nước thu Ďược hỗn hợp dịch chứa fucoidan lẫn alginate (ký hiệu là
FA-1 và FA-2). Tiếp tục rửa giải lần lượt bằng ethanol 5% và ethanol 15% thu Ďược các phân Ďoạn chứa laminaran (ký hiệu là FL5-1 hoặc FL5-2 và FL15-1 hoặc