khuẩn và nấm, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trờng dịch thể có thành phần nh môi trờng 2 nhng không có Agar.
3.2. Phơng pháp nghiên cứu
Để thu nhận đợc những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza từ mẫu rác chúng tôi sử dụng môi trờng 2. Môi trờng sau khi khử trùng đợc phân phối ra các đĩa petri vô trùng. Sau đó bao gói và đặt vào tủ ấm 300C trung bình 2 ngày cho khô mặt thạch và kiểm tra mức độ vô trùng của môi trờng. Chỉ những đĩa không bị nhiễm mới dùng để phân lập.
Mẫu rác lấy về phòng thí nghiệm đợc nghiền nhỏ rồi pha ở các độ loãng khác nhau bằng cách lấy 1g rác đã nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 99 ml nớc vô trùng, lắc đều rồi dùng pipet hút 1 ml dịch huyền phù từ bình sang ống nghiệm chứa 9 ml nớc vô trùng. Cứ nh vậy pha loãng tới nồng độ mong muốn.
Hút ở mỗi độ pha loãng 104, 105, 106 ra 0,1 ml dịch huyền phù và nhỏ vào các đĩa petri chứa môi trờng 2 đã vô trùng. Dùng que trang dàn đều dịch trên bề mặt môi trờng. Đậy nắp hộp lại, bao gói và nuôi trong tủ ấm ở 300C. Phía dới giá nuôi vi sinh vật đặt một khay nớc để tạo ẩm không khí thích hợp. Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trong 5 - 7 ngày.
Từ môi trờng phân lập, chọn các khuẩn lạc phát triển mạnh, mọc riêng rẽ dùng que cấy đầu tròn cấy dích dắc vào ống thạch nghiêng chứa môi trờng 2 đã vô trùng. Nuôi ở tủ ấm 300C trong 7 ngày cho vi sinh vật phát triển tốt rồi đa các ống giống vào bảo quản lạnh trong tủ lạnh 40C.
3.2.1.2. Phơng pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí
Cân 1g mẫu cho vào bình tam giác chứa 99 ml nớc vô trùng, lắc đều. Sau đó pha loãng, rồi dùng pipet vô trùng hút từ mỗi nồng độ pha loãng đó ra 0,1 ml dịch huyền phù và cấy lên các hộp petri chứa môi trờng 4 vô trùng. Dàn đều bằng que trang, đậy nắp, bao gói rồi đa vào nuôi trong tủ ấm. Sau 2 ngày đem ra đếm số lợng vi sinh vật.
Số lợng vi sinh vật hiếu khí đợc tính theo công thức sau: X = x . k. v
x: Số vi sinh vật trung bình trong một hộp petri k: Nồng độ pha loãng
v: Thể tích dịch huyền phù dùng để cấy.
3.2.2. Các phơng pháp hoá sinh
3.2.2.1. Chiết rút enzym
Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trờng lỏng với tốc độ lắc 200vòng/phút. Sau đó loại bỏ sinh khối, dịch trong thu đợc chính là dịch enzym thô.
3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xenlulaza ngoại bào
Để xác định khả năng sinh tổng hợp xenlulaza ngoại bào của nấm sợi chúng tôi sử dụng phơng pháp đục lỗ trên đĩa thạch, hiện màu bằng Lugol. Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc: Khi enzym xenlulaza thuỷ phân CMC (Cacboxymetyl Xenluloza) có trong thạch sẽ tạo thành vòng thuỷ phân màu vàng xung quanh lỗ trên nền xanh tím (do còn CMC). Dựa vào hiệu số giữa đ- ờng kính của vòng thuỷ phân và đờng kính của lỗ đục mà ta xác định đợc hoạt tính enzym xenlulaza của vi sinh vật.
Cách tiến hành nh sau:
- Hoà tan 20g Agar và 1g CMC bằng cách đun nóng trong 500 ml nớc cất. Sau đó thêm 500 ml dung dịch đệm xitrat - photphat 0,2 M (pH = 5,5).
- Đổ dịch lỏng vào các hộp petri sao cho chiều dày của lớp thạch khi đông lại là 3 mm.
- Nhỏ vào lỗ 0,2 ml dịch enzym, lỗ đối chứng nhỏ nớc cất.
- Để vào tủ lạnh trung bình 12h cho enzym khuếch tán sau đó cho vào tủ ấm 400C trong 6h để enzym tác dụng với cơ chất (CMC).
Lấy ra, cho vào mỗi đĩa 5 ml dịch Lugol, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết dịch Lugol đi.
- Đo vùng CMC bị phân giải xung quanh lỗ (Vùng mầu vàng trên nền xanh tím).
Hoạt tính CMC – aza biểu thị bằng hiệu số giữa đờng kính vòng phân giải và đờng kính lỗ khoan: D - d(mm)
Trong đó: D - Đờng kính vòng phân giải d - Đờng kính lỗ khoan
3.2.2.3. Xác định sinh khối nấm sợi
Cân giấy lọc đã đợc sấy khô ở 1050C đến trọng lợng không đổi. Dùng giấy lọc này lọc dịch nuôi cấy vi sinh vật rồi lại đem sấy khô đến trọng lợng không đổi. Cân và xác định trọng lợng khô của vi sinh vật theo công thức:
P = P2 - P1
P1: Trọng lợng khô của giấy lọc
P2: Trọng lợng khô của giấy lọc và vi sinh vật
3.2.2.4. Xác định sinh khối vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 2,5 ml dịch nuôi cấy vào ống li tâm. Lắc li tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút.
Thêm 1ml NaOH 2N lắc đều. Đun sôi cách thuỷ 5 phút sau đó làm lạnh. Cho thêm 0,5 ml CuSO4 2,5%, lắc đều. Đa vào máy li tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.
Mẫu đối chứng cũng làm tơng tự nhng thay dịch nuôi cấy bằng nớc cất. Dựng đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein (casein trong nớc cất) làm nh trên. So màu ở bớc sóng 555 nm. Sau đó dựng đồ thị chuẩn.