- Cột trắng là hàm lượng đồng phân 2,3,7,8TCDD
P.mendocina strain NCIB 1
P. monteilii strain CIP 104883
Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại chủng BHNA1. Thước đo thể hiện sự sai khác 5 nucleotide trên 1000 nucleotide so sánh
Từ cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng BHNA1 gần gũi nhất với P.
aeruginosa strain DSM. Xa hơn ở nhóm khác là P.indica strain IMT37 và
P.resinovorans strain LMG 2274.
Khi so sánh trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng BHNA1 có quan hệ gần
gũi với các đại diện vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Trình tự của gene 16S rRNA
ở chủng BHNA1 có mức tương đồng là 96% so với P. indicaIMT37, 95% so với
chủng P. resinovorans LMG 2274 vàP. otitidis MCC10330 và có quan hệ xa hơn
với P. stutzeri đã được biết đến với khả năng phân hủy carbazole/dioxin, đặc biệt là
đồng phân 2,3,7,8-TCDD [86]. Chi Pseudomonas cũng đã được phát hiện ở hầu hết
các nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và đtg [15,16] khi tách chiết DNA thẳng từ các mẫu đất, hồ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và phân tích đa dạng vi sinh vật bằng kỹ thuật DGGE.
Các đặc điểm của chi Pseudomonas đã được nghiên cứu và chúng có khả
năng phân hủy rất nhiều hợp chất vòng thơm chứa clo và không chứa clo. Trong nghiên cứu một số chủng vi sinh vật được phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
tại sân bay Đà Nẵng đã phát hiện ra chủng P. sp. SETDN1 có khả năng phát triển
trong môi trường muối khoáng có bổ sung dịch chiết đất có hàm lượng 2,3,7,8- TCDD là 35.000 ppt và phân hủy dioxin [25].
Dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào và trình tự đoạn gene 16S
rRNA có thể xếp chủng BHNA1 vào chi Pseudomonas và được ký hiệu là
Pseudomonas sp. BHNA1.
Kết quả phân lập và định tên vi khuẩn BHNA1 cho thấy đây là chủng vi khuẩn
thuộc chi Pseudomonas sử dụng 2,4-D đầu tiên được phân lập từ đất khu vực ô nhiễm
chất diệt cỏ/dioxin mới tại khu vực Tây sân bay Biên Hòa.
3.2.1.2. Phân loại chủng vi khuẩn BHNB1 Hình thái của chủng BHNB1 Hình thái của chủng BHNB1
Chủng BHNB1 có khuẩn lạc tròn, trắng đục, trơn, bóng, lồi nhẹ kích thước 1-1,2 mm (Hình 3.9). Để xác định tên của vi khuẩn đã thực hiện phân loại bằng xác định trình tự gene 16S rRNA.
Dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy chủng BHNB1 có các tế bào hình trụ ngắn dính kết với nhau tạo thành hình nhánh cây, điều này rất rễ dẫn đến nhầm lẫn chủng này thuộc nấm hoặc xạ khuẩn, nhưng chúng ta không quan sát thấy cuống sinh bảo tử của tế bào này nên có thể chủng BHNB1 thuộc lớp vi khuẩn.
Theo nghiên cứu của Brisou and Prévot (1954) và Juni (1984) đã mô tả hình
thái tế bào và đặc điểm vật lý của chủng Acinetobacter thì chúng có kích thước từ
0,9-1,6µm x 1,5-2,5 µm. Trong nghiên cứu này hình thái tế bào của BHNB1dưới
kính hiển vi điện tử quét, có hình que ngắn, gắn liền với nhau thành hình chuỗi với kích thước của mỗi tế nào vào khoảng 0,5 - 0,7µm x 1,0 - 1,2µm (Hình 3.10). Như vậy ta thấy có sự khác biệt về kích thước của chủng BHNB1 và kết quả nghiên cứu trên của Brisou và Prevot. Như vậy, cần các nghiên cứu bằng các phương pháp khác như xác định trình tự đầy đủ gene mã hóa 16S rRNA để làm rõ sự khác biệt mà dựa vào đặc điểm hình thái không thể phân loại được.
Trình tự gene mã hóa 16S rRNA của chủng BHNB1
Trong các nghiên cứu trước đây đã công bố cho thấy vi khuẩn phân hủy 2,4-D (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thuộc các chi Achromobacter, Arthrobacter, Burkholderia, Corynebacterium, Delftia,
Hình 3.10: Hình thái tế bào vi khuẩn BHNB1 dưới kính hiển vi điện tử
quét JEOL
Flavobacterium, Halomonas, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodoferax, Variovorax, Bradyrhizobium và Sphingomonas [68,117].
Sử dụng cặp mồi 27F và 1492R để nhân gene mã hóa 16S rRNA. Sản phẩm PCR đã được cắt băng sau khi làm sạch nhân lên để xác định trình tự. Cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng dựa vào trình tự gene và phần mềm BLAST.
Khi so sánh trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng BHNB1 có quan hệ gần
gũi với các đại diện vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter như A. lwoffii DSM 2403 với
độ tương đồng 94%; A. radioresistents DSM 6976 với độ tương đồng 91%; A.
venetianus strain ATCC 31012 độ tương đồng là 92% và một số các chủng khác như A. Baylyi strain B2, A. Junii strain DSM 6964.
Từ hình 3.11 ta có thể thấy chủng BHNB1 có quan hệ gần gũi nhất với
chủng A.lwoffii DSM 2403. Theo một nghiên cứu [48], chứng minh chủng A. lwoffii
bên cạnh 4 chủng khác đó là Comamonas sp; P. putidal; Acinetobacter sp và
Klebsiella oxytoca được phân lập từ đất nông nghiệp ở một số vùng của Mexico nơi mà 2,4-D được sử dụng rộng rãi. Các chủng vi khuẩn trên đều có thể sử dụng 2,4-D như là nguồn carbon và nguồn năng lượng duy nhất. Cũng theo nghiên này thì sự khoáng hóa 2,4-D đã được thực hiện bởi tập đoàn vi sinh vật trên.
Rất nhiều chủng Acinetobacter đã được phân lập từ môi trường mà ở đó có
sự phân hủy hydrocarbon và các vi khuẩn này đã rất được quan tâm để xử lý đất ô
nhiễm bằng biện pháp sinh học. Các vi khuẩn A. venetianus RAG-1, Acinetobacter
sp. M-1, Acinetobacter sp. ODDK71, A. venetianus spp. C3, C4 có khả năng phân
hủy ankan với số carbon từ C20 đến C44 trong khi A. radioresistens strain S8 lại có
khả năng phân hủy các chất hữu cơ mạch vòng [73].
Chủng A. baylyi GFJ2 đã được phân lập từ đất bị ô nhiễm chất diệt cỏ. Các
mẫu đất này được thu thập từ vài nguồn khác nhau bao gồm các mẫu đất sạch, đất và nước bề mặt từ các vùng nông nghiệp mà trong quá trình sản xuất có sử dụng các
chất diệt cỏ. Tuy nhiên nghiên cứu đã không thể kết luận chủng A. baylyi GFJ2 sử
phát triển của nó. Các bằng chứng thấy rất rõ chủng này có thể phân hủy các chất MCA, DCA, BA, và FA với nồng độ ban đầu là 0,2mM trong 100ml môi trường có chứa 1% theo thể tích tế bào và cuối cùng là giải phóng clo. Chủng này đã được phân
lập giống như loài vi khuẩn P.diminuta có khả năng phân hủy một cách có hiệu quả
4-chloroaniline (4CA), 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA). Ngoài ra vi khuẩn này còn có khả năng phân hủy hàng loạt các hợp chất halogen aniline như chlo-; brom- và
fluoro- [96]. So sánh trình tự gene 16S rRNA của chủng BHNB1 với A.baylyi thì độ
tương đồng không cao, chỉ là 91%.
Từ cây phát sinh chủng loại ta thấy chủng BHNB1 có quan hệ gần gũi nhất
với chủng A.lwoffiiDSM 2403, sau đó là hai chủng A.radioresistensDSM 6976 và
A.venetianusATCC 31012. Xa hơn ta thấy chủng này cũng có quan hệ với nhiều (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chủng vi khuẩn khác như Alkanindiges illinoisensis strain MVAB, Moraxella caviae
strain GP11, Perlucidibaca piscinae strain IMCC1704 và một số chủng trong nhóm
Pseudomonas như P.argentinensis strain CH01, P.lutea strain OK2, P.monteilii strain CIP 104883 và P.plecoglossicida strain FPC951 .
strain
Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại chủng BHNB1. Thước đo thể hiện sự sai khác 5 nucloeitide trên 1000 nucleotide so sánh
Phân tích đường cong quan hệ giữa thời gian - năng lượng với các thông số
năng lượng gồm hằng số tốc độ sinh trưởng, ½ nồng độ hạn chế sinh trưởng (IC50)
và ảnh hưởng nhiệt độ tổng số. Kết quả chỉ ra rằng khi nồng độ của pyrene là 400