Ở thực vật song tử diệp, rễ sơ cấp chiếm ưu thế so với rễ thứ cấp và được gọi là hệ thống rễ cọc. Rễ cọc hình thành phần lớn khối lượng của rễ và vẫn còn hiện diện suốt đời sống của thực vật, phát triển nhanh và đâm sâu xuống, gia tăng sự nâng đỡ và cho phép thực vật sử dụng vật chất nằm sâu bên trong đất. Rễ cọc phân nhánh thành những rễ thứ cấp và hình thành hệ thống rễ nhưng rễ cọc phát triển mạnh, các rễ bên phát triển ngày càng nhỏ, nhiều và có hầu hết ở song tự diệp và của nhiều cây hột trần.
Ở thực vật đơn tử diệp như cây học lúa (Poaceae), họ Dừa (Palmae), cây có nhiều rễ nhỏ, không có rễ nào chiếm ưu thế hơn so với những rễ còn lại và được gọi là hệ thống rễ chùm. Hệ thống rễ sợi mọc tương đối cạn, thường phát triển rộng lớn nằm gần trên bề mặt đất và ngăn chặn sự bào mòn phần bên dưới gốc thân.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
17
Hình 1.7. Hệ thống rễ cọc và rễ chùm
Nhiều loài thân bò như (rau má, rau muống), thân ngầm (ngải hoa, cỏ cú) mang nhiều rễ ở mắt của thân và được gọi là rễ bất định. Rễ bất định cũng có thể mọc từ kẽ răng của lá (lá trường sanh Kalanchoe). Thường các rễ bất định là các rễ chùm, trên đó có thể mang các rễ phụ nhỏ hơn. Rễ bất định ở dứa gai (Pandanus) to và mọc ở phần đáy của thân làm thành những cột chống thân trên bùn. Ở các cây da (Ficus), rễ bất định nảy sinh từ trên các nhánh cao, lúc đầu nhỏ và có dạng rễ bó, khi đụng đất, rễ phù to và mang rễ phụ trên đó [7].
2.4.4. Phƣơng pháp nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một số lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa biết được đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Tế bào thực vật cũng tuân theo qui luật trao đổi chất giống như tất cả các tế bào sinh vật khác. Qui luật tạo ra sản phẩm tiết kiệm nhất và hợp lý nhất ở các tế bào, đặc biệt là tế bào thực vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã được phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa
Chương 2: Tổng quan tài liệu
18
học đã đưa ra các hướng giải quyết để nuôi cấy tế bào đơn thực vật để thu sản phẩm bậc 2 như:
Không nên nuôi cấy tế bào đơn một cách đại trà mà không tính toán đến khả năng tạo ra những sản phẩm mong muốn. Do đó, cần phải chọn lựa một loài thực vật có khả năng tổng hợp ra những chất đang được quan tâm, đặc tính tổng hợp chất chuyên biệt này được một gen trong cấu trúc DNA quyết định và chúng có đặc tính loài rất cao.
Thực vật là cơ thể đa bào, do đó không phải tất cả các cơ quan đều có khả năng tạo chất cần quan tâm và xác định cơ quan nào có khả năng sinh tổng hợp chất đó để tiến hành nuôi cấy là điều rất quan trọng.
Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến hành tuyển chọn, lai tạo và chuyển gen để nâng cao năng suất tạo các sản phẩm bậc 2 mà ta cần quan tâm.
Quá trình chuyển hóa hay tổng hợp ở các tế bào thực vật cũng rất cần những cơ chất tương ứng. Vì vậy, việc cung cấp những cơ chất tương ứng để kích thích cho quá trình nuôi cấy là bắt buộc.
Tìm được môi trường đặc hiệu riêng cho từng loại tế bào.
Một số điểm cần chú ý: trước khi tạo thành mô rễ thì phải biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp chất cần quan tâm từ rễ, mẫu tế bào phải được lấy từ cơ quan (hay bộ phận) trên cây nói trên như tử diệp, trụ hạ diệp,.. và ở các bộ phận này, hàm lượng các chất yêu cầu có khả năng được tổng hợp hay chuyển hóa cao nhất. Mẫu tế bào phải sạch bệnh và nuôi cấy trong điều kiện vô trùng [8].
2.5.Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo rễ bất định in vitro
Tuổi và giai đoạn phát triển của cây: sự hình thành rễ từ mô của những cây còn non dễ hơn là từ những cây đã trưởng thành. Tử diệp có khả năng tái sinh cao hơn lá và cặp lá đầu tiên dễ tái sinh hơn các lá mọc sau.
Vị trí thu mẫu cấy trên cây: có những sự khác nhau lớn về khả năng tái sinh của các mẫu cấy trong cùng cơ quan. Về nguyên tắc, các mẫu cấy thu được trên cùng một cơ quan thực vật thì có khả năng tái sinh như nhau nhưng thực tế, mặc dù mẫu được thu
Chương 2: Tổng quan tài liệu
19
trên cùng một cơ quan nhưng khả năng tái sinh của mỗi mẫu cấy khác nhau là do một cơ quan được cấu tạo bởi nhiều mô khác nhau và có độ tuổi khác nhau.
Kích thước mẫu cấy: những mẫu cấy có kích thước lớn đôi khi dễ tái sinh hơn những mẫu cấy có kích thước nhỏ, có lẽ là do những mẫu lớn có nguồn dinh dưỡng dự trữ dồi dào hơn. Mặt khác, những mẫu cấy nhỏ có tỷ lệ diện tích vết thương lớn hơn so với mẫu lớn.
Cách đặt mẫu cấy vào trong môi trường nuôi cấy: cách đặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng ở nhiều loại cây. Sự tái sinh của mẫu cấy sẽ được kích thích nếu như cấy mẫu ngược đầu trên môi trường agar và ngược lại. Người ta cho rằng nguyên nhân có thể là do lượng O2 trên bề mặt môi trường nhiều hơn trong agar (Pierik và Steegman, 1975).
Oxygen: đóng một vai trò quan trọng trong sự tái sinh cơ quan từ mẫu cấy. Đây là một trong những lý do giải thích tại sao rễ tăng trưởng trong điều kiện in vivo tốt hơn trong điều kiện in vitro vì lượng O2 trong môi trường có agar thấp hơn lượng O2
trong đất. Rễ được tạo thành trong môi trường có agar có ít lông rễ hơn vì thiếu O2. Việc thông khí thường xuyên sẽ làm tăng sự ra rễ vì vậy sự ra rễ trong môi trường lỏng sẽ tốt hơn.
Ánh sáng: có tác dụng cản sự ra rễ. Cường độ ánh sáng cáo cản sự ra rễ mạnh hơn cường độ ánh sáng thấp. Tuy nhiên vẫn có một số trường hợp ngoại lệ như cúc đồng tiền (Murashige và cộng sự, 1974).
Đường: có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định vì sự hình thành rễ xảy ra trong tối hiệu quả hơn là ngoài sáng.
Auxin: hầu hết thực vật đều cần phải có auxin để cảm ứng sự ra rễ. Nhu cầu này sẽ thay đổi sau khi rễ đã được khởi tạo. Để cảm ứng sự ra rễ thì thực vật cần một nồng độ auxin cao nhưng để kéo dài phác thể rễ thì nồng độ auxin thấp là cần thiết. Các loại auxin có hiệu quả nhất trong sự kích thích ra rễ là IBA và NAA.
Chương 2: Tổng quan tài liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
20
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác: sự hình thành rễ bất định bị ức chế bởi cytokinin, GA3 và abscisic acid [8].
2.6.Một số nghiên cứu về nuôi cấy rễ để thu hợp chất thứ cấp
Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài qua trọng mang tính toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này.
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberine cao của loài C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 8
10 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1,66 g/l (Misawa 1995) [15].
Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể. Trong rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy callus P. ginseng để phân lập saponin và sapogenin. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất [14].
Chương 2: Tổng quan tài liệu
21
Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,04% khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A48 tháng tuổi (0,024%). Các tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng [22].
Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây
Lithospermum erythrorhizon. Bình thường, shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, người ta đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin [27].
Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu đã được thể hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng đã cho thấy các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vậy có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp.
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
22
CHƢƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Vật liệu
Vật liệu được chọn để làm nguyên liệu trong thí nghiệm là cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10.
Ảnh 2.1. Hạt giống cà rốt TN 10
3.2.Phƣơng pháp
Toàn bộ quá trình thí nghiệm nhằm hai mục tiêu chính: chọn thành phần môi trường tối ưu cho sự tăng sinh khối lượng rễ bất định in vitro và điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp carotenoid ở rễ bất định cây cà rốt.
Môi trường sử dụng để tạo cây mầm cà rốt là: môi trường Murashige và Skoog (1962).
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
23
Môi trường sử dụng để tăng sinh rễ bất định cây mầm cà rốt là: môi trường B5 (Gamborg, Miller và Ojima, 1960).
Các chất bổ sung: agar-agar, glucose, saccharose và NAA.
3.2.1. Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10.
Mục đích: Tạo cây mầm để thu nhận tử diệp và trụ hạ diệp làm nguyên liệu cho quá trình tạo rễ bất định.
t= 3 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(1) (2)
Ethanol (1 phút) Ethanol (30 giây)
Nước javel 0,1% (15 phút) Nước javel 0,1% (7 phút)
3 lần Môi trường MS Hạt giống Rửa bằng xà phòng Rửa nước Khử trùng Rửa nước Gieo hạt in vitro Cây mầm
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
24 Điều kiện nuôi cấy:
t° = 25 ± 2°C Độ ẩm : 70 ± 2%.
Cường độ chiếu sáng: 2800 ± 200 lux Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
Phương pháp tiến hành: Hạt giống cây mầm cà rốt Nhật TN 10 sau khi khử trùng theo quy trình được trình bày ở hình 2.1 được cấy in vitro vào chai thủy tinh 50 ml chứa 10ml môi trường MS, bổ sung saccharose 30 g/l, agar-agar 7 g/l. Hạt được nuôi trong tối, sau 7 ngày đem ra ngoài sáng để cây mầm quang hợp. Tiến hành khảo sát 2 chế độ khử trùng (1) và (2).
3.2.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt.
Mục đích: Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp làm nguyên liệu thu nhận carotenoid.
Môi trường B5, bổ sung NAA
Phương pháp tiến hành: Tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt Nhật TN10 14 ngày tuổi được cấy vào môi trường B5 có bổ sung saccharose 30 g/l, agar-agar 7 g/l, và NAA ở các nồng độ 0.5, 1, 1.5 mg/l. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện tối. Mẫu cấy sau khi tạo rễ sẽ được cấy chuyền sau mỗi 3 tuần.
Cây mầm
Trụ hạ diệp Tử diệp
Tạo rễ bất định
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
25
Sau 6 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ, chiều dài trung bình rễ và số lượng rễ trung bình/ mẫu nhằm chọn nồng độ NAA tối ưu cho quá trình tạo rễ bất định.
3.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích nuôi cấy lên sự gia tăng sinh khối rễ.
Mục đích: Chọn thể tích môi trường thích hợp cho sự tăng sinh khối của rễ. Phương pháp tiến hành: Rễ bất định trên môi trường đặc B5 bổ sung NAA 1.5 mg/l được chuyển qua nuôi ở môi trường lỏng B5 bổ sung NAA 1.5 mg/l và saccharose 30 g/l. Hệ thống nuôi cấy được đặt trên hệ thống lắc tròn với tốc độ lắc 100 rpm, ở trong điều kiện tối. Khảo sát với 3 thể tích khác nhau là 5, 7.5 và 10 ml. Khối lượng rễ bất định ứng với mỗi thể tích là 0.5 g.
Sau 14 ngày, tiến hành cân mẫu. Hệ số tăng sinh rễ được tính theo công thức:
2 1 1 n m m n