Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài qua trọng mang tính toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này.
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberine cao của loài C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 8
10 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1,66 g/l (Misawa 1995) [15].
Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể. Trong rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy callus P. ginseng để phân lập saponin và sapogenin. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất [14].
Chương 2: Tổng quan tài liệu
21
Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,04% khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A48 tháng tuổi (0,024%). Các tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng [22].
Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây
Lithospermum erythrorhizon. Bình thường, shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, người ta đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin [27].
Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu đã được thể hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng đã cho thấy các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vậy có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp.
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
22
CHƢƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Vật liệu
Vật liệu được chọn để làm nguyên liệu trong thí nghiệm là cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10.
Ảnh 2.1. Hạt giống cà rốt TN 10
3.2.Phƣơng pháp
Toàn bộ quá trình thí nghiệm nhằm hai mục tiêu chính: chọn thành phần môi trường tối ưu cho sự tăng sinh khối lượng rễ bất định in vitro và điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp carotenoid ở rễ bất định cây cà rốt.
Môi trường sử dụng để tạo cây mầm cà rốt là: môi trường Murashige và Skoog (1962).
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
23
Môi trường sử dụng để tăng sinh rễ bất định cây mầm cà rốt là: môi trường B5 (Gamborg, Miller và Ojima, 1960).
Các chất bổ sung: agar-agar, glucose, saccharose và NAA.
3.2.1. Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10.
Mục đích: Tạo cây mầm để thu nhận tử diệp và trụ hạ diệp làm nguyên liệu cho quá trình tạo rễ bất định.
t= 3 phút
(1) (2)
Ethanol (1 phút) Ethanol (30 giây)
Nước javel 0,1% (15 phút) Nước javel 0,1% (7 phút)
3 lần Môi trường MS Hạt giống Rửa bằng xà phòng Rửa nước Khử trùng Rửa nước Gieo hạt in vitro Cây mầm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
24 Điều kiện nuôi cấy:
t° = 25 ± 2°C Độ ẩm : 70 ± 2%.
Cường độ chiếu sáng: 2800 ± 200 lux Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
Phương pháp tiến hành: Hạt giống cây mầm cà rốt Nhật TN 10 sau khi khử trùng theo quy trình được trình bày ở hình 2.1 được cấy in vitro vào chai thủy tinh 50 ml chứa 10ml môi trường MS, bổ sung saccharose 30 g/l, agar-agar 7 g/l. Hạt được nuôi trong tối, sau 7 ngày đem ra ngoài sáng để cây mầm quang hợp. Tiến hành khảo sát 2 chế độ khử trùng (1) và (2).
3.2.2. Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt.
Mục đích: Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp làm nguyên liệu thu nhận carotenoid.
Môi trường B5, bổ sung NAA
Phương pháp tiến hành: Tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt Nhật TN10 14 ngày tuổi được cấy vào môi trường B5 có bổ sung saccharose 30 g/l, agar-agar 7 g/l, và NAA ở các nồng độ 0.5, 1, 1.5 mg/l. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện tối. Mẫu cấy sau khi tạo rễ sẽ được cấy chuyền sau mỗi 3 tuần.
Cây mầm
Trụ hạ diệp Tử diệp
Tạo rễ bất định
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
25
Sau 6 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ, chiều dài trung bình rễ và số lượng rễ trung bình/ mẫu nhằm chọn nồng độ NAA tối ưu cho quá trình tạo rễ bất định.
3.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thể tích nuôi cấy lên sự gia tăng sinh khối rễ.
Mục đích: Chọn thể tích môi trường thích hợp cho sự tăng sinh khối của rễ. Phương pháp tiến hành: Rễ bất định trên môi trường đặc B5 bổ sung NAA 1.5 mg/l được chuyển qua nuôi ở môi trường lỏng B5 bổ sung NAA 1.5 mg/l và saccharose 30 g/l. Hệ thống nuôi cấy được đặt trên hệ thống lắc tròn với tốc độ lắc 100 rpm, ở trong điều kiện tối. Khảo sát với 3 thể tích khác nhau là 5, 7.5 và 10 ml. Khối lượng rễ bất định ứng với mỗi thể tích là 0.5 g.
Sau 14 ngày, tiến hành cân mẫu. Hệ số tăng sinh rễ được tính theo công thức:
2 1 1 n m m n (I) 2
m : Khối lượng rễ sau 14 ngày. 1
m : Khối lượng rễ ban đầu. n : Số lần lặp.
3.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccharose bổ sung lên sự tăng sinh khối của rễ.
Phương pháp tiến hành: Rễ bất định trên môi trường đặc B5 bổ sung NAA 1.5 mg/l được chuyển qua nuôi ở môi trường lỏng B5 bổ sung NAA 1.5 mg/l, saccharose nồng độ lần lượt 30, 40 và 50 g/l. Tỷ lệ trọng lượng rễ/thể tích môi trường là 0.5 g/5 ml môi trường. Hệ thống nuôi cấy được đặt trên hệ thống lắc tròn với tốc độ lắc 100 rpm, ở trong điều kiện tối.
Sau 14 ngày nuôi cấy. Xác định hệ số tăng sinh rễ theo công thức (I)
3.2.5. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose lên sự sinh tổng hợp carotenoid.
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
26
Phương pháp tiến hành: Rễ bất định được nuôi trong môi trường lỏng B5 có bổ sung NAA 1.5 mg/l, saccharose 30 g/l và glucose nồng độ lần lượt 5, 10 và 15 g/l. Tỷ lệ trọng lượng rễ/thể tích môi trường là 0.5 g/5 ml môi trường. Hệ thống nuôi cấy được đặt trên hệ thống lắc tròn với tốc độ lắc 100 rpm, ở trong điều kiện tối.
Sau 14 ngày nuôi cấy. Xác định hệ số tăng sinh của rễ theo công thức (I).
3.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện ky. khí tạm thời lên sự sinh tổng hợp carotenoid ở rễ bất định cà rốt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp tiến hành: Rễ bất định được nuôi trong môi trường lỏng B5 có bổ sung NAA 1.5 mg/l, saccharose 30 g/l. Tỷ lệ trọng lượng rễ/thể tích môi trường là 0.5 g/5 ml. Hệ thống nuôi cấy được đặt trên hệ thống lắc tròn với tốc độ lắc 100 rpm, ở trong điều kiện tối. Trong quá trình nuôi cấy, hệ thống rễ được chuyển sang điều kiện kỵ khí tạm thời bằng cách thay đổi nút gòn bằng nút cao su (ảnh 2.2) rồi đưa trở về trạng thái nuôi cấy hiếu khí. Thời gian xử lý kỵ khí được trình bày ở bảng 2.1.
Ảnh 2.2 Nút gòn và nút cao su. Bảng 2.1. Thời gian xử lý hiếu khí và kỵ khí.
Số ngày hiếu khí 3 3 3
Số ngày kỵ khí 3 4 5
Số ngày hiếu khí 8 7 6
Sau 14 ngày nuôi cấy. Xác định hàm lượng carotenoid theo công thức (II).
Chương 3: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
27
Phương pháp tiến hành: Sau 14 ngày nuôi cấy, 0.5 g sinh khối rễ được nghiền và cho 10 ml dung môi acetone 80% v/v trong thời gian 5 phút để trích ly. Sau 5 phút, tiến hành lọc và đo OD ở các bước sóng 663.2, 646.8, 470 nm.
Công thức tính:
Đối với dung môi acetone 80%: (II)
Chlorophyl a (Ca) = 12.25 A663.2-2.79A646.8 (µg/ml). Chlorophyl b (C
b) = 21.50 A646.8 - 5.10 A663.2 (µg/ml). Caroten tổng C
(x+c)= (1000 A470- 1.82 Ca- 85.02Cb)/198 (µg/ml).
Sau đó, tính carotenoid trung bình ở từng lô (A,B và C) theo công thức:
( ) 1 ( ) n x c x c C C n (III) n: Số lần lặp.
Chương 4: Kết quả và bàn luận
28
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1.Tạo cây mầm in vitro từ hạt giống cây rau mầm cà rốt Nhật TN 10.
Ảnh 3.1. Cây mầm sau 14 ngày trên môi trường MS
Bảng 3.1. Tỷ lệ hạt nảy mầm và phát triển thành cây mầm hoàn chỉnh trên môi trường MS sau 14 ngày.
Hạt giống cà rốt Chế độ khử trùng
(1) (2)
Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) 56.92% 67.69%
Tỷ lệ tạo cây mầm hoàn chỉnh (%) 49.23% 61.54%
(1): Chế độ khử trùng ethanol 1 phút và nước javel 0.1% 15 phút. (2): Chế độ khử trùng ethanol 30 giây và nước javel 0.1% 7 phút.
Tỷ lệ nảy mầm trong điều kiện in vitro thấp hơn so với điều kiện nảy mầm in vivo in trên bao bì. Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm của hạt là ngoại yếu tố và nội yếu tố. Ngoại yếu tố gồm nước, oxi, nhiệt độ, ánh sáng, ...., nội yếu tố gồm khối lượng
Chương 4: Kết quả và bàn luận
29 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hạt, sự trưởng thành về sinh lý, các chất dinh dưỡng trong phôi, các chất điều hòa sinh trưởng... Để hạt nảy mầm tốt cần có đủ cả hai yếu tố này. Trước khi gieo vào môi trường MS, hạt trải qua giai đoạn khử trùng và đây là một trong những nguyên nhân chính làm giảm tỷ lệ nảy mầm này bởi vì nếu thời gian khử trùng mẫu quá dài sẽ làm hạt bị chết (chất khử trùng ngấm vào phôi) không còn khả năng sinh trưởng, còn nếu thời gian quá ngắn thì bề mặt hạt không được khử trùng tuyệt đối, khi gieo trong điều kiện in vitro hạt sẽ bị nhiễm. Ngoài ra, trong điều kiện nuôi cấy in vitro thì hạt giống cũng được cung cấp ít oxy hơn nhiều so với điều kiện in vivo do đó cũng làm giảm khả năng nảy mầm và tạo cây mầm.
4.2.Tạo rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt.
Ảnh 3.2. Rễ bất định từ trụ hạ diệp ứng với NAA 0.5, 1, 1.5 (mg/l) sau 14 ngày nuôi cấy.
Ảnh 3.3. Rễ bất định từ tử diệp ứng với NAA 0.5, 1, 1.5 (mg/l) sau 14 ngày nuôi cấy.
Chương 4: Kết quả và bàn luận
30
Kết quả về sự tạo rễ bất định khi nuôi cấy tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm cà rốt trên môi trường có bổ sung NAA như sau (bảng 3.2):
Bảng 3.2. Sự tạo rễ bất định từ tử diệp cây mầm cà rốt NAA (mg/l) Tỷ lệ tạo rễ (%) Chiều dài rễ (mm) Số lượng rễ /mẫu 0.5 77.5% 3.8 4.3 1 65% 3.8 5.1 1.5 68.75% 4.2 5.8
Bảng 3.3. Sự tạo rễ bất định từ trụ hạ diệp cây mầm cà rốt NAA (mg/l) Tỷ lệ tạo rễ (%) Chiều dài rễ (mm) Số lượng rễ trung bình/mẫu 0.5 45% 2.75 4.1 1 52.78% 1.74 2.9 1.5 46.88% 2 3.2
Môi trường cơ bản B5 bổ sung NAA với nồng độ 0.5, 1, và 1.5 mg/l đều có khả năng kích thích sự hình thành mô sẹo và rễ bất định từ trụ hạ diệp và tử diệp cây mầm cà rốt ở tuần thứ 2. Ở tử diệp, sự kéo dài rễ bất định diễn ra ở tuần thứ 3 và tiếp tục kéo dài. Ở trụ hạ diệp, sự kéo dài các rễ bất định diễn ra ở tuần thứ 3 nhưng tốc độ kéo dài chậm hơn. Kết quả ở bảng 3.2 và 3.3 cho thấy với tử diệp, sự tạo rễ bất định diễn ra rất mạnh, ở nồng độ NAA 1.5 mg/l thể hiện qua chiều dài cũng như số lượng rễ trung bình trên mẫu ở tuần 6. Theo Mai Trần Ngọc Tiếng và cộng sự (1980), sự tạo rễ trải qua 2 giai đoạn: giai đoạn tạo rễ sơ khởi từ vài tế bào của chu luân, và giai đoạn kéo dài các rễ này [10]. Nhiều loài thực vật và các cơ quan của cây có khả năng tạo rễ bằng phương thức giâm dưới sự kết hợp với hóa chất thích hợp, tác nhân cơ học và những điều kiện môi trường. NAA kích thích sự trương giãn của tế bào, hoạt hóa các quá trình tổng hợp các chất như protein,
Chương 4: Kết quả và bàn luận
31
cellulose, pectin và kìm hãm sự phân giải chúng, nhờ thế có thể kéo dài tuổi thọ của các cơ quan đồng thời làm tăng quá trình vận chuyển vật chất ở trong cây. Do đó, auxin đóng vai trò hoạt hóa gen để tổng hợp nên các enzyme cần thiết cho sự tổng hợp các vật chất đó. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng auxin ảnh hưởng mạnh đến hô hấp và quá trình phosphoryl hóa trong tế bào (Audus, 1959; Bonnet, 1957) []. Quá trình hô hấp cung cấp năng lượng và các tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào (Taiz và