- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy hạt lan Đuôi chồn
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nảy mầm của chồi hoa lan Đuôi chồn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh của chồi hoa lan Đuôi chồn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 39
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng ra rễ của chồi hoa lan Đuôi chồn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây con sau nuôi cấy mô
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu * Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu
- Vật liệu khử trùng: Quả lan Đuôi chồn có độ tuổi khoảng 10-12 tháng, được thu thập ngoài tự nhiên ( tại vườn quốc gia Ba Bể) từ những cây lan Đuôi chồn khỏe mạnh.
- Phương pháp xử lý mẫu: Quả lan còn xanh thu về được rửa sạch bằng dung dịch xà phòng loãng 5%, tráng qua bằng nước cất vô trùng sau đó đưa vào trong tủ cấy vô trùng bằng cách chuyển quả lan vào bình tam giác (250ml). Sau đó khử trùng bằng hoá chất khử trùng. Kết thúc khử trùng ta cắt quả lan Đuôi chồn thành 2- 4 phần, dùng dao và panh cạo hạt quả lan Đuôi chồn (mẫu nuôi cấy) cấy vào môi trường vào mẫu để đánh giá hiệu quả khử trùng và giúp mẫu ổn định trước khi đi vào nuôi cấy.
- Hóa chất khử trùng: Cồn, Clorox, H2O2 và Ca(OCL2).
- Các thí nghiệm tiến hành:
- Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại gồm 15 bình nuôi cấy (loại 250 ml), mỗi bình nuôi cấy được tính là một mẫu, trung bình lượng hạt của một quả lan được gieo đều cho 3 bình.
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới hiệu quả khử trùng mẫu cấy:
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Clorox đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn)
Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và được khử trùng bằng dung dịch Clorox dạng thương phẩm (chứa 5% gia ven). Các công thức thí nghiệm bố trí như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40
CT Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý
1 Không xử lý 4 10% + 5 phút
2 7% + 5 phút 5 10% + 10 phút
3 7% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thức
Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn)
Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và khử trùng bằng dung dịch H2O2 ở nồng độ và thời gian theo các công thức như sau:
CT Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý
1 Không xử lý 5 5% + 20 phút
2 3% + 10 phút 6 10% + 10 phút
3 3% + 20 phút 7 10% + 20 phút
4 5% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thức
Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống của mẫu (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng Calcium hypochloride Ca(OCl)2 đến khả năng vô trùng mẫu hạt nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn)
Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được thu hái, rửa bằng dung dịch xà phòng 5%, rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, chuyển quả lan qua bình tam giác và khử trùng bằng dung dịch Calcium hypochloride dạng thương phẩm (chứa 5% Ca(OCl)2). Các công thức thí nghiệm bố trí như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 41
CT Thời gian và nồng độ xử lý CT Thời gian và nồng độ xử lý
1 Không xử lý 4 10% + 5 phút
2 7% + 5 phút 5 10% + 10 phút
3 7% + 10 phút
Ghi chú: CT = Công thức
Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng bằng đốt quả đến khả năng vô trùng mẫu nuôi cấy (hạt phong lan Đuôi Chồn).
Quả lan Đuôi Chồn còn nguyên vẹn được rửa sạch bằng nước cất nhiều lần, lau khô quả, tiến hành đốt quả bằng cách nhúng ngập quả vào dung dịch cồn 96%, đưa quả ra khỏi dung dịch cồn và đốt quả để cồn cháy ở thời gian theo các công thức sau: CT1: (Đ/C): Không đốt; CT2: đốt trong 3 giây; CT3: đốt trong 5 giây; CT4: đốt trong 10 giây; CT5: đốt trong 15 giây.
Sau 10 ngày nuôi cấy, tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu bị nhiễm, tỷ lệ sống (chỉ tính những mẫu sống và không bị nhiễm), tỷ lệ chết của mẫu.
- Các chỉ tiêu theo dõi: (theo dõi sau 10 ngày)
+ Tỷ lệ mẫu nhiễm:
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =
Σ số mẫu nhiễm
X 100 Σ số mẫu đưa vào
+ Tỷ lệ mẫu sống (sạch - sống): Tỷ lệ mẫu sống (%) =
Σ số mẫu sống
X 100 Σ số mẫu đưa vào
+ Tỷ lệ mẫu chết (sạch – chết): Tỷ lệ mẫu chết (%) =
Σ số mẫu chết
X 100 Σ số mẫu đưa vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 42
* Giai đoạn tái sinh chồi
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi chồn
Quả lan sau khi khử trùng được chuyển vào đĩa peptri. Dùng dao tách bỏ vỏ quả và lấy hạt gieo trong bình nuôi cấy (250ml) đã chuẩn bị sẵn môi trường khác nhau, trung bình theo công thức thí nghiệm. Hạt thu từ một quả lan Đuôi Chồn được chia đều và nuôi cấy trên 3 - 4 bình. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại gồm 15 bình nuôi cấy (loại 250ml), mỗi bình nuôi cấy được tính là một mẫu. Sau 12 tuần tiến hành theo dõi số bình nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nảy mầm của hạt Lan Đuôi Chồn.
Thí nghiệm bố trí với 5 công thức (CT): CT1: ½ MS; CT2: MS; CT3: VW; CT4; N6; CT5: Hyponex. Ở các công thức, trong 1 lít môi trường bổ sung thêm: đường 30g + nước dừa 120 ml + than hoạt tính 2g + agar 6,5g.
- Các chỉ tiêu theo dõi: (theo dõi sau 12 tuần)
+ Số bình có hạt nảy mầm ( Số mẫu tái sinh) + Tỷ lệ nảy mầm:
Tỷ lệ nảy mầm (%) =
Σ số mẫu tái sinh
X 100 Σ số mẫu nuôi cấy
Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thích sinh trưởng đến khả năng nảy mẩm của hạt lan Đuôi Chồn
Môi trường nền sử dụng cho thí nghiệm là môi trường MS bổ sung thêm 30g đường + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than hoạt tính + 6g agar ( được tính để pha cho 1 lít môi trường nuôi cấy).
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi chồn trong nhân giống in vitro.
Thí nghiệm bố trí với 6 công thức (CT). Các công thức như sau: CT1 : MT nền + BAP(mg /l) 0,0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 CT2 : MT nền + BAP(mg /l) 0,3 CT3 : MT nền + BAP(mg /l) 0,5 CT4 : MT nền + BAP(mg /l) 0,7 CT5 : MT nền + BAP(mg /l) 1,0 CT6 : MT nền + BAP(mg /l) 1,3
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi chồn.
Thí nghiệm bố trí với 6 công thức (CT). Các công thức như sau: CT1 : MT nền + Kinetin (mg /l) 0,0 CT2 : MT nền + Kinetin (mg /l) 0,3 CT3 : MT nền + Kinetin (mg /l) 0,5 CT4 : MT nền + Kinetin (mg /l) 0,7 CT5 : MT nền + Kinetin (mg /l) 1,0 CT6 : MT nền + Kinetin (mg /l) 1,3
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp BAP và Kinetin đến khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi chồn.
Thí nghiệm bố trí 5 công thức theo các nồng độ của Kinetin và BAP trong 1 lít môi trường nuôi cấy như sau:
CT1(đ/c): Không bổ sung Kinetin và BAP
CT2: MT nền + BAP (mg/l) 0,1 + Kinetin (mg /l) 0,3 CT3: MT nền + BAP (mg/l) 0,2 + Kinetin (mg /l) 0,3 CT4: MT nền + BAP (mg/l) 0,3 + Kinetin (mg /l) 0,1 CT5: MT nền + BAP (mg/l) 0,3 + Kinetin (mg /l) 0,2
- Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu nảy mầm Tỷ lệ mẫu nảy mầm(%) =
Σ số mẫu (bình) nảy mầm
X 100 Σ số mẫu (bình) đưa vào
* Giai đoạn nhân nhanh chồi
Hạt lan đuôi chồn sau khi nuôi cấy trong bình nuôi cấy (250ml) trên môi trường MS, sau 8 tuần nuôi cấy nảy mầm và tạo cụm chồi. Tiến hành cấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44
chuyển qua môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cho quá trình nhân chồi, thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Môi trường nền sử dụng cho thí nghiệm là môi trường MS bổ sung thêm 30g đường + 120ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than hoạt tính + 6g agar ( được tính để pha cho 1 lít môi trường nuôi cấy)
Mỗi công thức nuôi cấy 15 bình (250ml), trung bình 5 mẫu/bình. Mỗi bình nuôi cấy có sự đồng đều về chất lượng chồi.
Sau 8 tuần nuôi cấy tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: số chồi, cụm chồi được hình thành và hệ số nhân chồi.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân chồi lan Đuôi Chồn.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi của lan Đuôi Chồn
Thí nghiệm bố trí với 5 công thức như sau: CT1 (đ/c): Không dùng BAP
CT2: MT nền + BAP (mg/l) 0,3 CT3: MT nền + BAP (mg/l) 0,5 CT4: MT nền + BAP (mg/l) 1,0 CT5: MT nền + BAP (mg/l) 1,5
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi của lan Đuôi Chồn
CT1 (đ/c): Không dùng Kinetin CT2: MT nền + Kinetin (mg/l) 0,3 CT3: MT nền + Kinetin (mg/l) 0,5 CT4: MT nền + Kinetin (mg/l) 1,0 CT5: MT nền + Kinetin (mg/l) 1,5
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của phối hợp của Kinetin và BAP đến khả năng nhân chồi của lan Đuôi Chồn.
Thí nghiệm bố trí với 5 công thức theo các nồng độ của Kinetin và BAP trong 1 lít môi trường nuôi cấy như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 CT1: MT nền + BAP (mg/l) 0,1 + Kinetin (mg /l) 0,2 CT2: MT nền + BAP (mg/l) 0,2 + Kinetin (mg /l) 0,3 CT3: MT nền + BAP (mg/l) 0,3 + Kinetin (mg /l) 0,5 CT4: MT nền + BAP (mg/l) 0,5 + Kinetin (mg /l) 1,0 CT5: MT nền + BAP (mg/l) 1,0 + Kinetin (mg /l) 1,5
- Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Số cụm chồi tạo ra: + Hệ số bật chồi:
Hệ số bật chồi =
Σ số lượng chồi bật Σ số chồi đưa vào + Chất lượng chồi:
* Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
- Mẫu nuôi cấy: Chồi hoa lan Đuôi chồn khỏe mạnh có từ 3 - 5 lá thu được từ quá trình nhân nhanh.
- Môi trường nền (MT nền) : Là môi trường MS, bổ sung 30 gram saccarose/lít, 6,5 gram agar/lít , pH = 5,8.
- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 4 chồi/CT.
Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến hiệu quả ra
rễ của lan Đuôi chồn sau 6 tuần nuôi cấy. Các công thức thí nghiệm: CT1 : MT nền + NAA (mg /l) 0,0
CT2 : MT nền + NAA (mg /l) 0,3 CT3 : MT nền + NAA (mg /l) 0,5 CT4 : MT nền + NAA (mg /l) 1,0 CT5 : MT nền + NAA (mg /l) 1,5
Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ sau 6 tuần nuôi cấy.Các công thức thí nghiệm:
CT1 : MT nền + IAA (mg /l) 0,0 CT2 : MT nền + IAA (mg /l) 0,3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46
CT3 : MT nền + IAA (mg /l) 0,5 CT4 : MT nền + IAA (mg /l) 1,0 CT5 : MT nền + IAA (mg /l) 1,5
Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA và IAA đến khả năng ra rễ sau 6 tuần nuôi cấy.Các công thức thí nghiệm:
CT1 : MT nền + NAA (mg /l) 0,3 + IAA (mg /l) 0,3 CT2 : MT nền + NAA (mg /l) 0,3 + IAA (mg /l) 0,5 CT3 : MT nền + NAA (mg /l) 0,3 + IAA (mg /l) 1,0 CT4 : MT nền + NAA (mg /l) 0,5 + IAA (mg /l) 0,3 CT5 : MT nền + NAA (mg /l) 0,5 + IAA (mg /l) 0,5 CT6 : MT nền + NAA (mg /l) 0,5 + IAA (mg /l) 1,0 CT7 : MT nền + NAA (mg /l) 1,0 + IAA (mg /l) 0,3 CT8 : MT nền + NAA (mg /l) 1,0 + IAA (mg /l) 0,5 CT9 : MT nền + NAA (mg /l) 1,0 + IAA (mg /l) 1,0
- Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Số rễ/cây
Số rễ/cây (rễ) = Tổng số rễ ra Tổng số cây tạo thành + Số rễ hữu hiệu = Tổng số rễ ra - Số rễ vô hiệu + Chiều dài rễ /cây: Tính từ cổ rễ đến chóp rễ
+ Màu sắc rễ
* Giai đoạn vƣờn ƣơm
Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng phát triển của cây con sau nuôi cấy mô.
- Vật liệu: cây hoa lan Đuôi chồn con sau nuôi cấy mô.
- Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, người ta thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài. Thời gian này có thể kéo dài khoảng 7 ngày và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây. Cây con trong bình cấy được rửa sạch những phần thạch hoặc đường bám vào vì chúng thường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47
là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Tiếp đó ngâm cây vào nước để tránh hiện tượng mất nước, rồi đem trồng vào giá thể.
- Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: Trong thời gian cây ở trong giá thể, tiến hành tưới phun 2 ngày/ lần bằng nước sạch (giữ ẩm độ giá thể).
- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 5 mẫu/CT.
- Các công thức của thí nghiệm:
CT 1: Rong biển + Than củi (1:1) CT 2: Rong biển
CT 3: Rong biển + Xơ dừa (1:1) CT 4: Than củi
CT 5: Xơ dừa
CT 6: Xơ dừa + Than củi (1:1)
- Các chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi 10 ngày/lần + Tỷ lệ cây sống
Tỷ lệ cây sống (%) =
Σ cây sống (cây)
x 100 Σ cây ra ngôi (cây)
+ Biến động số lá/cây: Số lá về sau - số lá ban đầu
+ Biến động chiều cao cây: Chiều cao về sau - chiều cao ban đầu
3.4. Xử lý số liệu:
Các số liệu thu được xử lý thống kê bằng phần mềm excel và chương trình xử lý Irristat.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy (hạt lan Đuôi chồn)
Mỗi loại hóa chất khử trùng có tác dụng tiêu diệt đối với những loại vi sinh vật (nấm, khuẩn) khác nhau. Tác dụng của mỗi loại hóa chất đối với vi sinh vật tùy thuộc vào nồng độ và thời gian khử trùng bằng hóa chất đó. Vì vậy, việc lựa chọn loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng bằng hóa chất đó cũng rất quan trọng. Nó quyết định đến sự thành công hay thất bại trong công tác khử trùng. Việc tiến hành nghiên cứu hiệu quả khử trùng của một số hóa chất thường sử dụng để khử trùng là Cồn, Clorox, H2O2 và Ca(OCL2) sẽ cho ta có một quyết định đúng đắn về loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp nhất.
Thí nghiệm 1: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa hất khử trùng Clorox đến tỷ lệ sống của mẫu hạt nuôi cấy (hạt lan Đuôi Chồn)
Bảng 1. Ảnh hƣởng của hóa chất khử trùng Clorox đến tỷ lệ sống của hạt lan Đuôi Chồn (sau 10 ngày nuôi cấy)
CT Số bình nuôi Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ chết (%)