DI
Bng 2.2 Thang đ im arlett dùng đánh giá mu hút qua mi (NTA), mu ni so
S l ng/ Lo i t bào i m 10 ậ 25 b ch c u +1 >25 b ch c u +2 T bào tr (m ) +1 10 ậ 25 t bào v y -1 >25 t bào v y -2 C ng t t c các đi m:
Barlett <= 0: b nh ph m không tin c y, l y l i m u.
Barlett = 1 ậ 2: ch a tin c y nghi ng . Có th nuôi c y ho c l y l i m u. Barlett >= 3: m u tin c y, ti p t c nuôi c y.
Nuôi c y phân l p:
M u b nh ph m đ c c y trên ba môi tr ng: CA, BA, BCP.
M u b nh ph m ph i đ c pha loãng theo t l m u: NaCl 0,85% là 1:1 n u m u đ c, nh y m đ c vƠ đ c vortex th t k tr c khi c y. Dùng pipet vô trùng l y m t ít đƠm (ch n vùng nh y m ) c y vào ba h p th ch CA, BA, BCP theo
ph ng pháp c y ria.
đ a BCP trong t m trong vòng 18 ậ 24 gi ; CA, BA trong t m 5% CO2
trong vòng 18 ậ 24 gi .
c và ghi nh n khóm trùng.
o i v i Klebsiella pneumoniae:
Trên môi tr ng CA: khu n l c nh y đ c, khúm to.
Hình 2.6. Khu n l c Klebsiella pneumoniae trên môi tr ng CA
Trên môi tr ng BA: khu n l c nh y đ c, khúm to, không tiêu huy t.
Trên môi tr ng BCP: nh y, vàng, khúm khu n l c to, tròn.
Hình 2.8. Khu n l c Klebsiella pneumoniae trên môi tr ng BCP
o i v i Pseudomonas aeruginosa:
Trên môi tr ng CA, BCP: khúm khu n l c l n, biên không đ u, có xanh
ánh kim, mùi th m đ c tr ng gi ng mùi nho khô.
Hình 2.9. Khu n l c Pseudomonas aeruginosa trên môi tr ng CA
Trên môi tr ng BA: khu n l c l n, biên không đ u, có xanh ánh kim, mùi
th m đ c tr ng gi ng mùi nho khô, gây tiêu huy t .
Th nghi m sinh hoá o S đ đnh danh m t s vi khu n đ ng ru t th ng g p: Hình 2.11. S đ đnh danh m t s vi khu n đ ng ru t th ng g p [21] KIA G(+), L(+), H2S(ậ) Escherichia coli Klebsiella Enterobacter Proteus agglomerans Citrate + ậ E. coli P.agglomeran Klebsiella Enterobacter Di đ ng + ậ Enterobacter Klebsiella Lysin + ậ E. coli P.agglomerans
o S đ đnh danh Klebsiella pneumoniae b ng m t s th nghi m sinh hóa
Hình 2.12. S đ đ nh danh K. pneumoniae b ng các th nghi m sinh hóa [15]
Th nghi m oxidase:
Nguyên t c: th nghi m này nh m xác đ nh s hi n di n c a h enzyme oxidase vi sinh v t. Thành viên quan tr ng nh t c a h th ng này là cytochrome oxidase trong chu i truy n đi n t c a hô h p hi u khí v i O2 là ch t nh n đi n t sau cùng nên ch hi n di n trong các loài vi sinh v t hi u khí hay k khí tu ý. S ch ng lo i cytochrome trong t bƠo thay đ i tu thu c vào t ng loài vi sinh v t.
Ho t tính cytochrome oxidase đ c phát hi n nh thu c th p ậ phenylenediamine.
Trong đi u ki n có s hi n di n c a cytochrome c kh trong t bào, thu c th này
b oxy hoá thành m t h p ch t indolphenol có mƠu xanh d ng. [7]
Th kh n ng lên men đ ng: th nghi m KIA K. oxytoca Gram (-), Oxidase (-) LDC E. cloacae K. pneumoniae Lactose (+) H2S Urease (+) Citrobacter freundii Indol Citrobacter koseri Indol Urease (ậ) E. coli E. aerogenes Indol + + + + + - - - - - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên t c: th nghi m này nh m xác đ nh kh n ng s d ng m t ngu n carbon nh t đnh b i vi sinh v t đ t ng tr ng. Th nghi m KIA dùng phân bi t nhóm sinh v t lên men glucose vƠ lactose đ ng th i bi t đ c kh n ng sinh h i vƠ
H2S c a vi khu n. Vi sinh v t lên men đ ng t o ra acid lƠm pH môi tr ng gi m, ch th màu s thay đ i đ ng th i sinh h i lƠm môi tr ng th ch b đ y lên ho c v
ra trong môi tr ng nuôi c y.
Klebsiella pneumoniae có kh n ng lên men c lactose và glucose làm pH
môi tr ng gi m. V i ch th mƠu phenol red lƠm môi tr ng chuy n sang vàng.
ng th i chúng có kh n ng sinh h i m nh nên làm v th ch ho c đ y môi tr ng lên cao.
Pseudomonas aeruginosa thu c nhóm tr c khu n không lên men đ ng nên
không lƠm thay đ i pH c a môi tr ng, do đó không lƠm đ i màu ch t ch th .
Th nghi m kh n ng sinh H2S [7]
Nguyên t c: m t s vi sinh v t t ng h p đ c enzyme desulfohydrase xúc tác s chuy n hoá trong đi u ki n k khí các acid amin ch a l u hu nh nh
cysteine, cystin, methione và phóng H2S. Thành viên quan tr ng nh t c a nhóm enzyme này là cysteine desylfohydrase. Các acid amin này là s n ph m c a quá trình thu phân protein thành acid amin. Khí H2S sinh ra s t o t a mƠu đen v i ch th sulfide ch a trong môi tr ng nuôi c y. Ngoài ngu n đ m h u c , H2S còn có th đ c t o ra do ph n ng kh thiosulfate Na2S2O3 b i enzyme thiosulfate reductase c a vi sinh v t đ t o ra sulfite và H2S.
Các h p ch t đ c s d ng trong môi tr ng làm ch th H2S có th là các h p ch t c a s t nh FeSO4, ammonium sulfate s t II ho c III. Khí H2S ph n ng v i ion s t s t o thành sulfide s t FeS không tan có mƠu đen. NgoƠi ra, acetate chì
Pb(C2H3O2) c ng có th đ c dùng làm ch th c a sulfide do h p ch t nƠy c ng
ph n ng v i H2S t o sulfide chì PbS không tan mƠu đen. Ch th acetate chì có đ
nh y cao cho phép phát hi n l ng nh H2S đ c t o ra nh ng loài vi khu n không thu c h Enterobacteriaceae, ví d nh Brucella.
Th nghi m kh n ng sinh H2S th ng đ c dùng đ phân bi t m t s loài thu c h Enterobacteriaceae nh Proteus.
Th nghi m kh n ng di đ ng
Nguyên t c: nh m xác đnh vi sinh v t có di đ ng hay không. Vi sinh v t di
đ ng th ng có tiên mao. Vi sinh v t di đ ng có th có m t hay nhi u tiên mao có
th phân b t i các v trí khác nhau trên t bào vi sinh v t.
Klebsiella pneumoniae không có tiên mao nên không có kh n ng di đ ng,
trên môi tr ng th ch vi khu n ch m c theo đ ng c y, ng c l i v i
Pseudomonas aeruginosa có tiên mao đ n c c do đó chúng m c lan ra kh i đ ng c y.
Th nghi m Citrate
M c đích: h ng d n k thu t th c hi n th nghi m citrate. Citrate là m t
trong nh ng th nghi m dùng phân bi t các nhóm loài vi khu n: Klebsiella (+), Enterobacter (+) v i Escherichia (ậ) ho c đ phân bi t Edwardsiella (ậ) v i Salmonella (+)
Nguyên lý: m t s vi khu n có kh n ng s d ng citrate làm ngu n carbon duy nh t đ thu l y n ng l ng và v t ch t. S bi n d ng citrate th ng thông qua s k t h p v i acetyl coA thƠnh oxaloacetate đ vào chu trình Kreb. S bi n d ng
citrate thay đ i tu theo pH c a môi tr ng. khi pH t ng môi tr ng chuy n sang
ki m l ng acetate và format t o thành s t ng trong khi lactose vƠ CO2 gi m. pH trung tính s n ph m ch y u là CO2 và acetate. pH acid s n ph m t o ra ch y u
lƠ acetoin vƠ lactate. Nh v y s bi n d ng citrate b i vi khu n t o ra CO2 làm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ki m hoá môi tr ng. M t khác các vi khu n có kh n ng sinh citrate lƠm ngu n
carbon duy nh t đ u có kh n ng dùng mu i amonium làm ngu n đ m duy nh t. S phân gi i mu i amonium trong môi tr ng s sinh NH3 làm ki m hoá môi tr ng.
Nh v y trong môi tr ng th nghi m kh n ng s d ng làm ngu n carbon
duy nh t có ch a đ m d ng amonium, kh n ng t ng tr ng c a vi khu n s th hi n qua kh n ng bi n d ng ngu n carbon citrate và ngu n đ m amonium làm
t ng giá tr pH c a môi tr ng. s gia t ng giá tr pH nƠy đ c ch th b ng s thay
đ i màu c a ch th pH trong môi tr ng.
Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa có enzyme citrate permease có kh n ng bi n d ng citrate làm ngu n carbon t o NH3 làm ki m hoá
môi tr ng, ch th màu bromothymol blue trong môi tr ng ki m t màu l c chuy n thành xanh d ng.
Th nghi m decarboxylase [7]
Nguyên t c: các lo i vi khu n đ ng ru t khác nhau trong m c đ c m ng t o thành các enzyme carboxylase có vai trò xúc tác lo i b nhóm carboxyl m t s acid amin t o ra amine ho c diamine và CO2 trong đi u ki n k khí. Các enzyme này ch đ c c m ng t ng h p khi môi tr ng có tính acid và ch a ch t c m ng
đ c hi u. H decarboxylase g m nhi u thành viên, m i lo i ch tác đ ng lên m t c
ch t nh t đnh. Có 3 lo i decarboxylase quan tr ng trong ki m nghi m vi sinh v t là lysine decarboxylase (LDC), ornithine decarboxylase (ODC) và arginine
decarboxylase (ADC) có c ch t t ng t là lysine, ornithine và arginine. Ph n ng
đ c xúc tác b i LDC s lo i b CO2 ra kh i lysine, phóng thích CO2 và d n đ n s t o thành cadaverine. Tr ng h p ODC và ADC s n ph m t o ra là CO2 và putrescine. Ngoài ra, arginine còn có th đ c chuy n hoá thành citruline nh xúc tác c a enzyme arginine dihydrolase (ADH) tr c khi đ c chuy n hoá ti p thành putrescine và CO2. Do v y th nghi m arginine decarboxylase (ADC) c ng đ c kí hi u là ADH. Trong t t c các tr ng h p nêu trên, CO2 sinh ra lƠm t ng pH c a
môi tr ng vƠ đ c ghi nh n qua s đ i màu c a ch th pH.
Các th nghi m decarboxylase th ng đ c dùng đ phân lo i vƠ đ nh danh các loài vi khu n đ ng ru t h Enterobacteriaceae.
Klebsiella pneumoniae có enzyme lysine decarboxylase thu phân lysine phóng thích CO2 và d n đ n s t o thành cadaverine, CO2 sinh ra lƠm t ng pH c a
môi tr ng vƠ đ c ghi nh n qua s đ i màu c a ch th màu.
Th nghi m urease
Nguyên t c: m t s vi sinh v t t ng h p enzyme urease xúc tác s thu phân c a urea. Urea (NH)2CO là diamide c a acid carbonic. Urease thu c nhóm các amidase xúc tác s thu phân c a liên k t amide gi a C ậ N trong phân t urea đ
gi i phóng hai phân t NH3 và CO2. Enzyme này ho t đ ng t i u pH 7,0, thu c nhóm enzyme c u trúc, hi n di n th ng xuyên trong t bào không ph thu c vào
s hi n di n hay không c a c ch t là urea. S phóng thích NH3 và CO2 lƠm t ng
pH c a môi tr ng và có th đ c theo dõi qua s đ i màu c a ch t ch th pH.
Th nghi m urease lƠ đ c tr ng cho các loƠi Proteus spp. vƠ th ng dùng đ
phân bi t các d ng Proteus v i các thành viên khác c a Enterobacteriaceae.
Klebsiella pneumoniae t ng h p enzyme urease xúc tác s thu phân c a urea, gi i phóng hai phân t NH3 và CO2 lƠm t ng pH môi tr ng v i ch th màu phenol red làm chuy n mƠu môi tr ng sang h ng cánh sen.
Th nghi m kh n ng sinh Indol.
Nguyên t c: tryptophan là m t acid amin có th b oxy hoá b i m t s vi sinh v t có h enzyme tryptophanase t o ra các s n ph m ch a g c Indol. S n ph m trung gian chính c a ph n ng oxi hoá tryptophan là indolpyruvic acid IPA. Phân t
nƠy sau đó b bi n đ i theo h ng lo i nhóm amin (deamination) thành indol hay
theo h ng lo i nhóm carboxyl (decarboxylation) thành skatol. Tryptophanase xúc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tác ph n ng lo i nhóm amin đ t o thành indol. Vi c phát hi n indol đ c th c hi n b ng ph n ng c a phân t này v i các thu c th ch a p ậ
Dimethylaminobenzaldehyd (p ậ DMABA). Nhân pyrol c a indol ch a nhóm CH2 s k t h p v i nhân benzene c a p ậ DMABA t o nên m t ph c ch t d ng quinone
có mƠu đ .