Thiết bị

Các thiết bị đƣợc sử dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bao gồm:

- Máy PCR PTC-100 (MJ Research, Inc., Mỹ), GeneAmp PCR System 9700 (ABI, Mỹ).

- Máy xác định trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer (ABI, Mỹ).

- Pipetman các loại (Gilson, Pháp).

- Bể điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ) - Bể ổn nhiệt (Tempette Junior Techne). - Máy khuấy trộn Vortex (OSI Rotolab). - Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ). - Lò vi sóng (Sharp, Nhật Bản).

- Máy chụp ảnh (Bio-Rad, Mỹ).

- Máy làm khô chân không (Automatic Environmental Speed-Vac

System, AES 1010, Savant, Mỹ).

- Máy ly tâm lạnh (Biofuge, Sorvall).

- Máy li tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, CHLB Đức). - Tủ lạnh sâu -20oC, -80C (Sanyo, Nhật Bản).

2.1.3. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc nhập khẩu từ các hãng Fermentas, Sigma Aldrich, Promega… Các hóa chất này gồm có:

- Bộ hóa chất dùng cho PCR: đệm, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase… của hãng Fermentas.

- Cặp mồi H1255 và L16725 đƣợc đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen. + H1255: 5’- CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC -3’

+ L16725: 5’- AGG ACT ACG GCT TGA AAG C -3’ - Hóa chất chạy điện di:

+ Agarose.

+ Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X. + Thang DNA chuẩn.

+ Dung dịch đệm tra mẫu: Glycerol 20%; Tris-Cl 0,1 M (pH = 8); EDTA 0,01 M (pH = 8); bromophenol blue 0,25%.

+ Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr).

- Bộ hóa chất thôi gel: Kit Wizard SV gel and PCR Clean - up System của hãng Promega:

 Dung dịch MBS (Membrane Binding Solution).

 Dung dịch MWS (Membrane Wash Solution) có bổ sung ethanol 95%.

- BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied BioSystems (ABI, Mỹ) phục vụ cho giải trình tự vùng D-loop.

- Ethanol 100% và 70%. - Nƣớc khử ion vô trùng.

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

Đề tài đƣợc thực hiện tạiPhòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu H1255 và L16725 để nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể từ các mẫu DNA tổng số. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% và tinh sạch để đọc trình tự trực tiếp. Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng. Các phƣơng pháp sử dụng đƣợc trình bày sau đây.

2.2.1. Điện di trên gel agarose

Nguyên tắc chung:

Điện di là kỹ thuật đƣợc sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA sản phẩm của PCR [13].

Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH = 7) do sự có mặt của gốc PO4

3-

. Do đó, khi đặt nucleic acid trong điện trƣờng với cƣờng độ và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ dịch chuyển qua bản gel từ cực âm (cathode) sang cực dƣơng (anode). Trên cùng một bản gel, với cùng một cƣờng độ dòng điện, những phân tử DNA khác nhau về trọng lƣợng nên khác nhau về điện tích và chạy đƣợc những quãng đƣờng khác nhau sau cùng một khoảng thời gian. Gel đƣợc sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamide. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, ngƣời ta dùng phƣơng pháp làm hiện hình. Đối với gel agarose, ngƣời ta nhuộm bằng EtBr. Chất này sẽ gắn xen vào các base của phân tử DNA và phát quang dƣới tia tử ngoại. Nhƣ vậy cho phép dễ dàng phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel và có thể phân biệt đƣợc phân tử DNA trên cùng một bảng gel. Đối với gel polyacrylamide, các phân tử thƣờng đƣợc đánh dấu bằng

đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng trên bản gel sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi [13].

Trong điện di, ngƣời ta sử dụng thang DNA chuẩn cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh DNA mẫu với DNA chuẩn để biết trọng lƣợng phân tử, hoặc trích li đƣợc các DNA khác nhau [13].

Quy trình kỹ thuật:

Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệ thống soi chụp gel. Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng gel agarose 0,8% bởi nồng độ này phù hợp với kích thƣớc trung bình của các đoạn DNA cần phân tích.

- Cân 0,8 g thạch agarose vào 100 ml đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò vi sóng đun cho gel nóng chảy và không tạo bọt.

- Để nguội đến khoảng 50 - 55oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lƣợc. Đợi thạch đông và ổn định.

- Sau khi gel đông lại thì rút răng lƣợc ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 - 5 mm. Ở đây, chúng tôi dụng đệm TAE 1X.

- Tra mẫu DNA: trộn một lƣợng mẫu thích hợp với 3 l dung dịch đệm tra mẫu (loading dye), sau đó tra vào các giếng trên bản gel. Tra DNA chuẩn vào một giếng, đậy nắp bản gel và cắm điện cực.

- Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 - 120 V, cƣờng độ 60 - 80 mA trong khoảng 30 phút.

- Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và nhuộm bản gel trong EtBr 10 g/ ml. Lấy bản gel ra sau 5 - 10 phút và rửa trong nƣớc sạch.

2.2.2. Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Reaction)

Kỹ thuật PCR (hay còn gọi là kỹ thuật nhân bản gen in vitro), do Kary Mullis và đtg phát minh vào năm 1985, đƣợc xem là một phát minh có tính đột phá lớn, tạo ra một cuộc đại cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử. PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu nhân dòng gen, các phân tích cận lâm sàng cũng nhƣ trong nghiên cứu phân loại học phân tử.

Nguyên tắc:

Kỹ thuật PCR phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của enzyme DNA polymerase để nhân bản in vitro các đoạn gen lên hàng triệu lần qua một loạt các chu kỳ lặp lại [1], [13].

Tuy nhiên, do enzyme DNA polymerase hoạt động cần các mồi (primer) nên ngƣời ta phải biết đƣợc các trình tự nucleotide ở hai đầu DNA để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Trong điều kiện thích hợp và môi trƣờng có chứa các nucleotide tự do, enzyme sẽ kéo dài đoạn mồi thành sợi bổ sung với sợi làm khuôn [1], [13].

Thành phần phản ứng PCR:

- Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần nhân bản và chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide.

- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Đây là tín hiệu chỉ hƣớng đi (5’ - 3’) của enzyme DNA - polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung.

- Dung dịch đệm cung cấp ion Mg2+ và nƣớc tinh khiết không có enzyme RNase và DNase.

- Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase [1], [13].

Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 - 50 µl.

Các giai đoạn:

Phản ứng PCR gồm một loạt chu kỳ lặp lại của ba giai đoạn cơ bản sau đây [1], [13]:

- Giai đoạn biến tính DNA bằng nhiệt: tách sợi DNA kép thành dạng sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme (phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trƣớc đó) trong giai đoạn này đều bị dừng lại. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào.

 Nhiệt độ: 94 - 95o

C, tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép bị tách ra do sự đứt gãy của các liên kết hydro.

 Thời gian: khoảng 1 phút

- Giai đoạn gắn mồi: thực hiện phản ứng lai giữa mồi và DNA khuôn. Các mồi đƣợc gắn vào vị trí có trình tự tƣơng đồng ở DNA khuôn mẫu, mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion đƣợc tạo thành và đứt gãy liên tục giữa mồi sợi đơn và DNA khuôn sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các mồi đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (DNA khuôn và mồi) Taq

polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.

 Nhiệt độ: ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ đƣợc sử dụng có thể rất rộng tuỳ thuộc vào trình tự nucleotide của mồi, thông thƣờng khoảng 55o

C, nhƣng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên đến 68o

C.

 Thời gian: 20 giây đến 2 phút

- Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ lúc này đƣợc nâng lên đến 72oC, đây là nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ

sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có mồi gắn vào theo chiều 5’ - 3’. Ở nhiệt độ này, các mồi bắt cặp chính xác không bị rời khỏi DNA khuôn mẫu do có các mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ liên kết, trong khi đó các mồi ở các vị trí bắt cặp không chính xác sẽ bị rời ra khỏi khuôn (do nhiệt độ cao) do đó không tổng hợp đƣợc DNA từ những mồi này. Thời gian của giai đoạn này từ 30 giây đến vài phút, tuỳ thuộc chiều dài đoạn DNA cần nhân bản.

Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép ban đầu tổng hợp đƣợc 2 sợi DNA kép mới. Cứ nhƣ vậy, phản ứng xảy ra trong 25 - 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đƣợc duy trì ở 72oC trong khoảng từ 5 - 10 phút sao cho tất cả các phản ứng enzyme diễn ra hoàn toàn. Sau đó nhiệt độ đƣợc hạ xuống 4oC để bảo quản sản phẩm.

Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8 - 2 %.

Hiện nay, kỹ thuật PCR đã đƣợc phát triển, cải tiến so với ban đầu. Ngƣời ta đƣa vào thêm một số bƣớc phụ nhƣ khởi động nóng nhằm làm sợi DNA kép biến tính hoàn toàn, kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi ở chu kì cuối cùng và giữ mẫu ở 4o

C.

2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR

Để thu đƣợc các sản phẩm PCR đủ độ sạch để có thể tiến hành đọc trình tự trực tiếp, chúng tôi tiến hành cắt gel (thạch) sau đó tinh sạch bằng Kit Wizard SV Gel and PCR clean-up system của hãng Promega theo quy trình kỹ thuật sau:

- Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành cắt gel trên máy soi DNA để thu lấy băng DNA quan tâm. Thêm 10 l dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) đối với mỗi 10 mg gel và ủ hỗn hợp ở 50 - 65o

- Đặt cột nhỏ vào trong ống thu. Chuyển hỗn hợp sản phẩm PCR và dung dịch bám màng vào trong cột nhỏ và để 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC và đổ dịch thừa.

- Bổ sung 700 l dung dịch MWS (Membrane Wash Solution) có bổ sung ethanol 100%. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC, đổ dịch thừa.

- Lặp lại bƣớc trên với 500 l dung dịch MWS, ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4oC. Đổ dịch thừa và ly tâm lại trong 1 phút.

- Chuyển cột nhỏ sang ống 1,5 ml sạch. Sấy khô sản phẩm PCR trong máy làm khô chân không, thời gian 5 phút. Thêm 30 l nƣớc cất hai lần, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 - 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 5 phút ở 4o

C, sau đó giữ mẫu DNA tinh sạch ở -20o

C.

2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop

Nguyên tắc chung:

Trình tự vùng D-loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của phƣơng pháp do Sanger và đtg phát minh vào năm 1977: tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau 1 nucleotide kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang (fluochrome). Mỗi loại ddNTP đƣợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Nhƣ vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrylamid, kết quả sẽ đƣợc xử lí qua một hệ thống vi tính [1], [13], [56].

Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã đƣợc đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng nhân bản DNA để đọc trình tự bao gồm: mồi

L16725: 3,2 pmol, 200 ng DNA khuôn (sản phẩm PCR đã tinh sạch), BigDye 0,5X, đệm 1X và H2O với tổng thể tích 15 l.

Chu trình nhiệt:

Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại DNA trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 nhƣ sau: 96oC - 4 phút; 25 chu kỳ (96oC - 10 giây, 50oC - 5 giây, 60oC - 4 phút). Sản phẩm đƣợc giữ ở 4oC.

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/ EDTA:

- Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 l EDTA 125 mM (pH = 8); 60 l EtOH 100%. Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở -20oC, 3 giờ. Sau đó ly tâm 12000 rpm, 15 phút để tủa DNA trong đó.

- Loại bỏ EtOH và rửa tủa bằng 60 l EtOH 70%. Ly tâm 12000 rpm trong 10 phút.

- Làm khô tủa và bổ sung 10 l Hi-Di TM Formamide để làm tan tủa và biến tính ở 95o

C trong 5 phút.

Sau bƣớc này các mẫu đƣợc đƣa vào các giếng của khay đựng mẫu sau đó điện di trong ống mao quản 80 cm x 50 m chứa POP-4™ của hãng ABI, Mỹ. Vùng điều khiển D-loop đƣợc xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer.

2.2.5. Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng

Dữ liệu về trình tự vùng D-loop đƣợc xử lý bằng phần mềm DNA Sequencing Analysis v5.3.1, SeqScape® v2.6 và BioEdit v7.0.9.

Trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu đƣợc so sánh với trình tự chuẩn bằng thuật toán ClustalW. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu đƣợc tính toán bằng phƣơng pháp Maximum Composite Likelihood. Cây phát sinh chủng loại của 71 mẫu gà đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp NJ (Neighbor-Joining) và phƣơng pháp ML (Maximum Likelihood). Tất cả các phân tích trên đều đƣợc thực hiện thông qua phần mềm Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA) v4.0 [63].

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR

D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xƣơng sống. Vùng này chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và các promoter phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trƣng tích luỹ các đột biến cao gấp 5 - 10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA nhân, D-loop trở thành vùng có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Chính vì thế, nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Đông Tảo và Tre, chúng tôi chọn trình tự nucleotide của vùng D-loop hệ gen ty thể làm đối tƣợng nghiên cứu.

Nhân gen bằng kỹ thuật PCR thành công khi phản ứng có tính đặc hiệu cao. Do đó, để cho ra sản phẩm tốt nhất thì điều kiện phản ứng phải đƣợc tối ƣu hóa. Để nhân vùng D-loop cần có DNA khuôn, mồi, các dNTP, Taq DNA