Mụ́i quan hệ định tớnh đƣợc xỏc định giữa hoạt tớnh sinh học và cỏc tớnh chất húa-lý của chất đang đƣợc cụ́ gắng làm sỏng tỏ. Vào những năm 1960, Hansch và cụ̣ng sự đã đƣa ra quan niệm rằng quỏ trỡnh húa-lý chung gõy ra bởi phản ứng sinh học khụng chỉ là quỏ trỡnh cõn bằng mà cũn là quỏ trỡnh tĩnh (quan niệm này khỏc với cỏc quan niệm đƣợc đƣa ra trƣớc đõy). Nhiều kết quả nhƣ hoạt tớnh sinh học cho thấy rằng hoạt tớnh sinh học thể hiện qua cỏc hằng sụ́ tƣơng đƣơng nhƣ ED50, LD50, nồng đụ̣ gõy đụ̣c, %... trong mụ̣t khoảng thời gian xỏc định.
Page 28
Bằng việc khảo sỏt cỏc mụ́i quan hệ cỏc tớnh chất húa-lý nhƣ thụng sụ́ ƣa dầu π, hằng sụ́ σ Hammett đặc trƣng cho bản chất nhúm thế X so với hydro, Hansch đã đƣa ra phƣơng trỡnh tổng quỏt sau:
log(1/Co) = -kπ2 + k’ππ0 – k”π0 + ρσ + k’” (1)
trong đú ρ là hằng sụ́ liờn quan đến phản ứng mà phõn tử đú gõy ra.
Khi xột thờm cỏc yếu tụ́ cụ̣ng hƣởng, cấu dạng, khụng gian … ta thu đƣợc phƣơng trỡnh sau:
log(1/Co) = -kπ2 + k’ππ0 – k”π0 + ρσ + kEsEs + k’” (2) ở đõy Es là thụng sụ́ khụng gian Taft.
Trong thực tế phƣơng trỡnh (1) cũn đƣợc đơn giản húa thành cỏc dạng đơn giản hơn nhƣ sau.
- Dạng 1: Trong trƣờng hợp đơn giản nhất khi πo lớn so với π và σ rất nhỏ thỡ phƣơng trỡnh (1) trở thành:
log(1/C) = aπ + b
- Dạng 2: Khi σ = 0 và πo, π cú giỏ trị gần bằng nhau thỡ phƣơng trỡnh là: log(1/C) = -aπ2 + bπ + c
- Dạng 3: Khi π khụng cú ảnh hƣởng quan trọng (ớt nhất trờn mụ̣t diện rụ̣ng) trong việc xỏc định hoạt tớnh của mụ̣t dãy chất thỡ:
log(1/C) = ρσ + c
- Dạng 4: Khi π0 lớn hơn so với π và σ là đỏng kể thỡ phƣơng trỡnh (1) trở thành: log(1/C) = aπ + ρσ + c
- Dạng 5: Là dạng phƣơng trỡnh (1) ỏp dụng cho tỡnh huụ́ng phức tạp nhất.
Page 29
NẤM MEN
1.6.1. Cấu trỳc của vi khuẩn
Vi khuẩn gồm cú nhiều hỡnh thỏi, kớch thƣớc và cỏch sắp xếp khỏc nhau và đều rất nhỏ và rất nhẹ. Hỡnh dạng chủ yếu của vi khuẩn là hỡnh cầu (cầu khuẩn), hỡnh que (trực khuẩn), hỡnh dấu phẩy, hỡnh xoắn, hỡnh cú cuụ́ng, hỡnh cú sợi…. Vỡ vi khuẩn rất nhỏ và trong suụ́t nờn để nghiờn cứu cấu trỳc của vi khuẩn ngƣời ta phải thực hiện phƣơng phỏp nhuụ̣m màu vi khuẩn. Phƣơng phỏp nhuụ̣m phổ biến là phƣơng phỏp nhuụ̣m màu Gram. Nhờ phƣơng phỏp này mà vi khuẩn đƣợc chia làm 2 nhúm lớn là Gram dƣơng và Gram õm. Nhúm vi khuẩn Gram dƣơng cú đặc tớnh khụng bị dung mụi hữu cơ tẩy màu thuụ́c nhuụ̣m ban đầu nờn cú màu của thuụ́c nhuụ̣m ban đầu là màu tớm. Nhúm vi khuẩn Gram õm bị dung mụi tẩy màu thuụ́c nhuụ̣m màu ban đầu nờn nú cú màu của thuụ́c nhuụ̣m bổ sung (đỏ vàng với Safranin hay đỏ tớm với Fuchsin). Cấu trỳc của vi khuẩn gồm:
a. Thành tế bào là lớp cấu trỳc ngoài cựng cú đụ̣ rắn chắc nhất định để duy trỡ hỡnh dạng tế bào và cú khả năng bảo vệ tế bào đụ́i với mụ̣t sụ́ điều kiện bất lợi. Vỡ nồng đụ̣ đƣờng và muụ́i bờn trong tế bào thấp hơn bờn ngoài tế bào nờn tế bào hấp thu rất nhiều nƣớc từ bờn ngoài vào. Nếu khụng cú thành tế bào vững chắc thỡ tế bào sẽ vỡ. Thành phần cấu tạo cả thành tế bào rất phức tạp. Cấu trỳc của thành tế bào vi khuẩn Gram-(+) và Gram-(-)rất khỏc nhau. Ở vi khuẩn Gram-(-) lớp ngoài cựng của thành phần tế bào là 2 lớp lipopolysaccarit cú đan xen với cỏc phõn tử protein. Thành tế bào vi khuẩn Gram-(+) cú thể bị phỏ hủy hoàn toàn thành thể nguyờn sinh khi chịu tỏc dụng của lizozim. Ở vi khuẩn Gram-(+) cú đến hơn 50% khụ́i lƣợng khụ của thành tế bào là peptidoglican trong khi vi khuẩn Gram-(-) tỉ lệ này chỉ là 5-10%.
b. Màng tế bào chất cú cấu tạo bởi 2 lớp phosphorlipit (PL). Mỗi phõn tử PL chứa mụ̣t đầu tớch điện phõn cực (đầu photphat) nằm phớa trong và mụ̣t đầu khụng tớch điện, khụng phõn cực (đầu hydrocacbon).
Page 30
c. Tế bào chất trong tế bào chất cú protein, axit nucleic, hydratcacbon, lipit, cỏc ion vụ cơ và nhiều chất cú khụ́i lƣợng phõn tử khỏc nhau.
d. Thể nhõn là mụ̣t nhiễm sắc thể duy nhất đƣợc cấu tạo bởi mụ̣t sợi AND xoắn kộp gắn với màng tế bào chất.
e. Bào nhầy thành phần chủ yếu là polysaccarit.
f. Tiờn mao và khuẩn mao: tiờn mao giỳp cho vi khuẩn chuyển đụ̣ng. Sợi tiờn mao tạo bởi cỏc phõn tử của mụ̣t loại protein đặc biệt. Khuẩn mao cú bản chất protein, chỳng cú chức năng giỳp vi khuẩn bỏm giữ vào giỏ thể. Vi khuẩn Gram-(-) thƣờng cú khuẩn mao. Rất nhiều vi khuẩn Gram-(-) cú khuẩn mao là cỏc vi khuẩn gõy bệnh (chẳng hạn vi khuẩn gõy bệnh lậu Neisseria gonorrhoeae).
g. Bào tử gồm màng ngoài (thành phần chủ yếu là lipoprotein, mụ̣t ớt axit amin, cú tớnh thẩm thấu kộm); lớp ỏo bào tử (chủ yếu là protein sừng và mụ̣t ớt phosphorlipoprotein) cú sức đề khỏng rất cao với lizozim, proteinaza, cỏc chất hoạt đụ̣ng bề mặt cú tớnh thấm kộm đụ́i với cỏc cation; lớp vỏ bào tử (chứa mụ̣t lƣợng lớn peptidoglican đặc biệt, ớt liờn kết chộo, ngoài ra cũn cú 7-10% chất dipicolinat canxi, khụng chứa axit teicoic); lừi bào tử (chứa mụ̣t lƣợng rất ớt nƣớc, khụng cú axit teicoic nhƣng lại cú dipicolinat canxi).
1.6.2. Cấu trỳc của nấm men
Nấm men cú nhiều hỡnh dạng khỏc nhau, thành của nấm men đƣợc cấu tạo bởi glucan và mannan. Mụ̣t sụ́ nấm men cú thành tế bào chứa kitin và mannan. Dƣới lớp thành tế bào là lớp màng tế bào chất chứa chủ yếu là protein, lipit và mụ̣t ớt polysaccarit.
1.6.2. Khả năng gõy bệnh của một số vi khuẩn và nấm men
Page 31
Gõy bệnh tiờu chảy, nhiễm trựng đƣờng tiết niệu, viờm màng não và nhiễm trựng huyết do vi khuẩn Gram-(-).
- Cầu khuẩn Gram-(+) Staphylococcus epidermidis:
Gõy nhiễm trựng bệnh viện, vi khuẩn thƣờng gõy nhiễm trựng cathetherr và khớp giả. Gõy viờm nụ̣i tõm mạc.
- Nấm men Candida albicans:
Gõy bệnh Candidiasis xuất hiện khi thiếu hụt hệ vi khuẩn bỡnh thƣờng (ở trẻ mới sinh), suy giảm miễn sinh (ngƣời nhiễm HIV…). Gõy bệnh tƣa miệng, viờm õm đạo, viờm thực quản, nhiễm Candida toàn thõn.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
Điểm núng chảy đƣợc đo bằng phƣơng phỏp đo mao quản trờn mỏy đo điểm núng chảy STUART SMP3 (BIBBY STERILIN-Anh). Phổ hồng ngoại đƣợc ghi trờn mỏy phổ FTIR Magna 760 (NICOLET, Mỹ) bằng phƣơng phỏp đo phản xạ trờn mẫu bụ̣t KBr hoặc ộp viờn với KBr. Phổ 1H NMR và 13
C NMR đƣợc ghi trờn mỏy phổ AVANCE AV500 Spectrometherr (BRUKER, Đức) ở tần sụ́ mỏy 500 MHz, dung mụi DMSO-d6, chất chuẩn nụ̣i TMS. Phổ MS đƣợc ghi trờn mỏy phổ LC-MS-OBBITRAP- XL Thermo SCIENTIFIC-USA bằng phƣơng phỏp ESI.
Page 32 O OH OH O H O H OH 1, Ac2O/ HClO44 O Br OAc AcO AcO OAc 2, Br2//P đỏ/ H2O Pb(SCN) 2 toluen O H OAc H H OAc H NCS AcO H AcO H2N-NH2.H2O O OAc AcO NHCSNH-NH 2 AcO OAc Ar-COCH3 Ar = nhõn phenyl O OAc AcO NHCSNH-N=C(CH 3)-Ar AcO OAc 2.1. TỔNG HỢP 2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-α-D-GALACTOPYRANOSYL BROMIDE O OH OH O H O H OH 1, Ac2O/ HClO44 O Br OAc AcO AcO OAc 2, Br2//P đỏ/ H2O
Nhỏ từng giọt 2,4 ml acid percloric 54% vào trong bỡnh cầu ba cổ dung tớch 250 ml cú chứa 40 ml anhydrid acetic, lắp mỏy khuấy, nhiệt kế, sinh hàn hồi lƣu. Khi nhỏ giọt acid percloric, phản ứng toả nhiệt mạnh nờn tụ́c đụ̣ nhỏ giọt khoảng 1-2 giõy/giọt để giữ đƣợc nhiệt đụ̣ của phản ứng dƣới 20oC. Sau đú, dung dịch đƣợc làm ấm lờn nhiệt đụ̣ phũng và thờm từ từ 10 gam α-D-galactose với tụ́c đụ̣ sao cho nhiệt đụ̣ của
Page 33
phản ứng khoảng 30-40oC. Khi cho hết galactose vào, khuấy thờm khoảng 30 phỳt nữa. Sau khi làm lạnh hỗn hợp phản ứng xuụ́ng dƣới 20oC, thờm vào hỗn hợp phản ứng 3 gam phosphor đỏ đã đƣợc sấy khụ. Tiến hành nhỏ giọt 18 gam (5,8 ml) brom với tụ́c đụ̣ nhỏ giọt 5 giõy/giọt để nhiệt đụ̣ phản ứng khụng quỏ 20oC. Sau khi hết brom, 3,6 ml nƣớc đƣợc nhỏ giọt vào bỡnh phản ứng, khuấy mạnh. Khi nhỏ giọt nƣớc, phản ứng toả nhiệt rất mạnh nờn để giữ nhiệt đụ̣ phản ứng tụ́c đụ̣ nhỏ giọt nƣớc cũng là 5 giõy/giọt. Đõy là giai đoạn hoàn thiện phản ứng. Khi hết nƣớc, khuấy tiếp 30 phỳt ở nhiệt đụ̣ dƣới 20oC. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy thờm 2 giờ nữa ở nhiệt đụ̣ phũng. Thờm 30 ml dicloromethan đƣợc thờm vào hỗn hợp phản ứng, lắc mạnh, lọc qua bụng vào cụ́c thu đƣợc dung dịch nhớt màu vàng. Thờm đỏ vào cụ́c khuấy tan, chiết lấy lớp dicloromethan ở dƣới. Cho tiếp dicloromethan vào lớp dung mụi ở trờn, chiết tiếp để thu đƣợc hết sản phẩm. Trung hoà sơ bụ̣ hỗn hợp sản phẩm bằng dung dịch NaHCO3 bão hoà. Tổng thể tớch dung dịch NaHCO3 bão hoà dựng hết là 70 ml. Cho toàn bụ̣ lƣợng dung dịch trờn vào phễu chiết, lắc kĩ, chiết ra cụ́c. Làm khụ nhanh bằng CaCl2 mịn. Sau đú lọc phần dung dịch trờn và đem cụ cạn dung mụi dƣới ỏp suất giảm. Để sản phẩm thu đƣợc vào tủ lạnh để lạnh để dựng cho phản ứng chuyển hoỏ tiếp thành dẫn xuất isothiocyanat. 2.2. TỔNG HỢP 2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-GALACTOPYRANOSYL ISOTHIOCYANAT O Br OAc H H AcO H H AcO H OAc Pb(SCN)2 toluen O H OAc H H AcO H NCS AcO H OAc
Hỗn hợp phản ứng gồm 4 gam (0,015 mol) muụ́i chỡ thiocyanat, 5 gam (0,012 mol) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl bromide trong 30 ml toluen, lắc mạnh, đun nhẹ đến khi tan hết. Lắp sinh hàn hồi lƣu, hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu mạnh
Page 34
trong 3 giờ đƣợc dung dịch cú màu vàng đậm. Đun núng sản phẩm, lọc trờn giấy lọc, dựng toluen khan để rửa sản phẩm đọng lại trờn giấy lọc. Đem dung cụ cạn dung mụi dƣới ỏp suất giảm. Sản phẩm chỉ tan trong ether và khụng tan trong n-hexan. Thờm từng lƣợng nhỏ ether vào để hoà tan sản phẩm, lƣợng ether dựng hết khoảng 40 ml. Đổ dung dịch thu đƣợc ra cụ́c, thờm khoảng 20 ml n-hexan, khi cho n-hexan vào xuất hiện kết tủa trắng. Đem lọc sản phẩm thu đƣợc bằng phễu lọc Buchner và kết tinh lại từ ethanol. Đnc 97-99oC. Theo tài liệu [34] đụ́i với tetra-O-acetyl--D-galaccopyranosyl isothioxyanat, hiệu suất đạt 80%, tn/c = 97-99oC.
2.3. TỔNG HỢP 2,3,4,6-TETRA-O-ACETYL-β-D-GALACTOPYRANOSYL THIOSEMICARBAZID O OAc OAc NCS AcO OAc H2N-NH2.H2O O OAc OAc NHCSNH-NH 2 AcO OAc
Cho vào bỡnh cầu 500 ml gồm CH2Cl2 (140 ml) và (0,082 mol, 32 g) tetra-O-
acetyl-β-D-galactopyranosyl isothiocyanat, hỗn hợp đƣợc làm lạnh sõu và đƣợc khuấy trờn mỏy khuấy từ. Tiếp tục nhỏ từ từ hỗn hợp gồm 4,5 ml hydrazin hydrat và 140 ml CH2Cl2 vào hỗn hợp đƣợc làm lạnh.Sau khi nhỏ hết thỡ hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy thờm 1 giờ ở nhiệt đụ̣ 0-5oC và 2 giờ ở 20oC. Sau đú cất loại dung mụi thu đƣợc dạng siro màu vàng đậm, đổ dạng siro vào cụ́c chứa 150 ml ethanol 96%, đỏnh bụng dạng siro ta thu đƣợc dạng bụ̣t màu trắng. Lọc và rửa trờn phễu Buchnerr thỡ thu đƣợc tetra- O-acetyl-β-D-galactopyranosyl thiosemicarbazid cú Đnc=198‒199oC,hiệu suất 71%.
Page 35