Các phương thức cơ bản của kỹ thuật DNA tái tổ hợp là: (1) Gắn một đoạn DNA vào một phân tử DNA (như là vector) có thể tái bản, và (2) cung cấp một môi trường cho phép sao chép phân tử DNA đã được gắn.
Có ba nhóm vector được dùng phổ biến để tạo dòng các đoạn DNA ngoại lai và tái bản (sao chép) trong E. coli; đó là plasmid, bacteriophage l và cosmid. Tất cả những vector này phải có một số tính chất cần thiết sau:
- Chúng có khả năng tự tái bản trong E. coli.
- Mang các gen chỉ thị chọn lọc để dễ dàng phân biệt và tinh sạch vector của thể tái tổ hợp với các dạng khác.
- Chúng có các vùng DNA không cần thiết cho sự sinh sản trong vi khuẩn, vì thế DNA ngoại lai có thể được đưa vào trong các vùng này.
- Chúng có thể biến nạp vào tế bào vật chủ một cách dễ dàng.
1. Plasmid vector
Plasmid là các thông tin di truyền ngoài nhân có trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1- ³ 200 kb, có khả năng tự sao chép để tồn tại độc lập trong tế bào. Các plasmid có thể mang một số gen của vi khuẩn và các gen này có thể biểu hiện ra protein.
DNA của plasmid có thể được phân lập từ nuôi cấy vi khuẩn chứa plasmid bằng cách bổ sung chất tẩy (như là sodium dodecyl sulfate-SDS) và ly tâm sự sinh tan (lysate)1. Phức hợp nhiễm sắc thể vi khuẩn, lớn hơn plasmid nhiều, sẽ lắng xuống đáy của tube ly tâm, plasmid siêu xoắn và các đoạn nhiễm sắc thể mạch thẳng giữ lại trong thể nổi. Plasmid siêu xoắn một lần nữa được phân tách bằng ly tâm sau khi xử lý với CsCl và EtBr.
Plasmid mang các gen mã hóa cho các enzyme thường có lợi cho vi khuẩn vật chủ. Các plasmid có thể mang các kiểu hình khác nhau như: kháng kháng sinh, sản xuất kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, sản xuất các enzyme hạn chế và enzyme biến đổi (modification enzymes).
Các plasmid có thể được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi vi khuẩn được xử lý để tế bào có thể cho thấm qua nhất thời đối với các phân tử DNA nhỏ. Quá trình này được biết như là sự biến nạp (transformation). Vi khuẩn được biến nạp thành công có thể được chọn lọc dựa trên kiểu hình mới mà chúng nhận được từ plasmid, chẳng hạn khả năng kháng các kháng sinh.
Một số plasmid hiện diện trong tế bào có số bản sao thấp, một hoặc một vài bản sao trên tế bào, do DNA của plasmid chỉ sao chép một hoặc hai lần trước khi tế bào phân chia. Tuy nhiên, các plasmid khác tồn tại một số bản sao lớn hơn (10 tới 100 bản sao trên một tế bào) do DNA tái bản lặp lại cho đến khi đạt được số bản sao thích hợp. Các plasmid có số bản sao lớn được gọi là plasmid dạng xoắn lỏng lẻo (relaxed plasmid), và đây là một trong những tính chất hữu ích
Hình 9.3. Plasmid vector pBR322. Apr (hay Ampr) và Tetr: gen kháng ampicillin và tetracycline, ori: trình tự khởi đầu sao chép, và một số vị trí nhận biết cho các RE. tự khởi đầu sao chép, và một số vị trí nhận biết cho các RE.
Hình 9.4. trình bày một loại plasmid vector thế hệ thứ ba là pUC19, đây là loại vector tạo dòng đặc trưng, Nó mang vùng tạo dòng (multiple cloning sites) hay còn gọi là vùng đa nối (polylinker), vùng khởi đầu sao chép (ori), và hai gen chỉ thị (gen kháng ampicillin và gen lacZ’). Ampicillin là loại kháng sinh giết chết tế bào vi khuẩn, nhưng những vi khuẩn nào chứa vector pUC19 sẽ kháng lại loại kháng sinh này. Gen lacZ’ mã hóa enzyme β-galactosidase, bình thường enzyme này cắt lactose để sản xuất ra glucose và galactose. Enzyme này cũng cắt X-gal để tạo ra một cơ chất màu xanh; khi X-gal được bổ sung vào môi trường, các khuẩn lạc vi khuẩn chứa pUC19 sẽ có màu xanh và dễ dàng nhận biết. Vùng polylinker của vector pUC19 là tập hợp một số vị trí nhận biết đơn của các enzyme hạn chế cho phép gắn đoạn DNA ngoại lai vào plasmid.
Hình 9.4. Plasmid vector tạo dòng đặc trưng pUC19. Mang các vị trí cắt hạn chế đơn trong vùng tạo dòng, vùng khởi đầu sao chép (ori), và hai gen chỉ thị (gen Apr và gen lacZ’). dòng, vùng khởi đầu sao chép (ori), và hai gen chỉ thị (gen Apr và gen lacZ’).
Plasmid có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng enzyme hạn chế. Vì thế, các đoạn được tạo ra có thể tạo vòng bằng cách kết hợp các đầu dính bổ sung. Hơn nữa, các đoạn được tạo ra bởi một enzyme đặc biệt hoạt động trên một phân tử DNA sẽ có đầu tương đồng (đầu dính) với đoạn được tạo ra bởi cùng một enzyme hoạt động trên một phân tử DNA khác. Vì thế, các đoạn từ hai phân tử DNA khác nhau, từ hai cơ thể khác nhau có thể kết hợp bằng các liên kết hydrogen thuận nghịch khi các đoạn này được trộn lại.
Nếu sự kết hợp được gắn lại sau khi bắt cặp, thì các đoạn được kết hợp cố định bền vững, sự kết hợp của các đoạn này được thực hiện nhờ enzyme DNA ligase (còn gọi là polynucleotide ligase) liên kết cộng hóa trị các phân tử tái tổ hợp bằng cách tạo ra liên kết phosphodiester giữa nhóm 5’-PO4 của polynucleotide này với nhóm 3’-OH của polynucleotide khác.
Hình 9.5. Phương thức cơ bản để tạo dòng gen trong vi khuẩn E. coli
Hình 9.5 trình bày toàn bộ phương thức sản xuất DNA tái tổ hợp (tạo dòng gen). Plasmid được cắt ở các vị trí xác định bằng enzyme hạn chế. DNA của một genome ngoại lai được cắt bởi cùng một loại enzyme, một số đoạn trong đó có thể có gen quan tâm. Plasmid và các đoạn của genome được phối trộn và kết hợp nhờ enzyme DNA ligase. Các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn bằng đồng nuôi cấy plasmid và vi khuẩn.
2. Bacteriophage l vector
Các bacteriophage có nhiều ưu điểm khi được sử dụng làm vector tạo dòng. Vector dược sử dụng rộng rãi nhất là bacteriophage l để gây nhiễm vào tế bào E. coli. Một trong những ưu điểm chính của phage l là có hiệu quả chuyển DNA vào trong tế bào vi khuẩn cao. Ưu điểm thứ hai là một phần ba của genome phage l là không cần thiết cho sự xâm nhiễm và sinh sản của nó trong tế bào vật chủ, không có những gen này, một tiểu thể l vẫn chuyển thành công DNA của nó vào vi khuẩn và sinh sản được. Các gen không cần thiết này, khoảng >15 kb, có thể được thay thế bằng một đoạn DNA ngoại lai khoảng 15-23 kb. Ưu điểm thứ ba là DNA sẽ không bị đóng gói trong vỏ l trừ khi nó dài từ 40-50 kb; vì thế các đoạn DNA ngoại lai không bao giờ được chuyển vào tế bào trừ khi chúng được chèn vào trong genome phage l, điều kiện cần thiết để đảm bảo đoạn DNA ngoại lai sẽ được tái bản sau khi nó vào trong tế bào vật
Hình 9.6.Bacteriophage λ là một vector tạo dòng hiệu quả
3. Cosmid vector
Các vector phage l chỉ có thể mang các đoạn DNA có kích thước khoảng 15-23 kb. Tuy nhiên, các cosmid vector lại mang được các đoạn DNA có kích thước lớn hơn nhiều, khoảng 45 kb.
Hình 9.7. Tạo dòng trong cosmid. Hai vị trí cos gần vị trí cắt hạn chế ScaI và BamHI. DNA nguồn bị cắt bởi BamHI để phân đoạn có kích thước khoảng 45 kb. Phân tử plasmid DNA được cắt bởi BamHI và ScaI. bởi BamHI để phân đoạn có kích thước khoảng 45 kb. Phân tử plasmid DNA được cắt bởi BamHI và ScaI. Hai mẫu DNA này được trộn vào nhau và được gắn bằng T4 DNA ligase. Sau khi gắn xong, những phân tử này được đóng gói trong phần đầu của phage l, và những phần tử có thể lây nhiễm sẽ được hình thành sau khi tạo đuôi.
Cosmid là các plasmid nhỏ mang các vị trí cos của phage; chúng có thể được đóng gói trong vỏ virus và được chuyển vào vi khuẩn nhờ sự xâm nhiễm của virus. Do tất cả các gen virus, ngoại trừ các vị trí cos, là không có, nên cosmid có thể mang các đoạn DNA ngoại lai lớn hơn hai lần các đoạn mà phage l vector có thể mang. Các cosmid vector có các thành phần sau: (1) một điểm khởi đầu sao chép của plasmid (ori); (2) một số các vị trí cắt hạn chế đơn; (3) một hoặc hơn các gen chỉ thị chọn lọc; và (4) các vị trí cos cho phép đóng gói DNA trong đầu của phage.
DNA ngoại lai được chèn vào trong cosmid trong cùng một phương thức với plasmid: cosmid và DNA ngoại lai đều được cắt bởi cùng một RE để tạo ra các đầu bổ sung (đầu dính), và chúng được liên kết với nhau bằng DNA ligase. Các cosmid tái tổ hợp được hợp nhất trong vỏ, và các tiểu thể phage được sử dụng để xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn, ở đó cosmid sẽ tái bản như một plasmid. Bảng 9.2 so sánh các tính chất của các vector plasmid, phage l và cosmid.
Bảng 9.2.So sánh các vector plasmid, phage l và cosmid
4. Thư viện cDNA
Xây dựng một thư viện cDNA bao gồm năm bước chính sau: - Tinh sạch mRNA từ RNA tổng số của một phận cơ thể sinh vật.
- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase).
- Gây biến tính (đun sôi) thể lai mRNA-cDNA để phá hủy sợi mRNA bằng RNase H của E. coli. Tổng hợp sợi cDNA thứ hai từ khuôn mẫu sợi cDNA thứ nhất nhờ enzyme DNA polymerase với primer là vòng cặp tóc của nó để thu được phân tử cDNA sợi đôi.
- Cắt vòng cặp tóc bằng enzyme nuclease S1 và dùng enzyme Klenow sửa chữa hai đầu của sợi đôi cDNA để tạo ra đầu bằng.
- Gắn các đoạn nối (linker) vào hai đầu của cDNA sợi đôi trước khi tạo dòng trong vector thích hợp để xây dựng thư viện cDNA.
5. Thư viện genomic DNA
Thư viện genomic DNA là một tập hợp các đoạn DNA cùng đại diện cho một genome nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn) của cá thể mà DNA được bắt nguồn từ đó. Các thư viện được dùng chủ yếu hoặc để sàng lọc theo các phương pháp khác nhau nhằm phân lập một (hoặc các) trình tự nucleotide quan tâm đặc biệt, hoặc để xác định vị trí và thứ tự của các trình tự trong genome mà từ đó thư viện được xây dựng (physical mapping).
Xây dựng một thư viện genomic DNA bao gồm bốn bước chính: Cắt DNA, gắn DNA vào vector, đóng gói các dòng tái tổ hợp trong vỏ protein của virus để làm bước trung gian trước khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, và chuyển cấu trúc đó vào tế bào vật chủ.
Thư viện genomic DNA có nhiều ứng dụng, chẳng hạn để lập bản đồ vật lý (physical mapping) của DNA và xác định các gen gây bệnh hoặc các chuỗi DNA quan tâm cho những phân tích khác.
Sản xuất ra các dòng mang các đoạn chèn DNA khác nhau nhưng gối lên nhau có nhiều thuận lợi và thư viện có thể được sử dụng trong quá trình chromosome walking. Chromosome walking thường được thực hiện với thư viện của cosmid, phage l hoặc YAC2.
Các thư viện genomic DNA cũng cần thiết cho việc xác định các gen gây bệnh bằng cách tạo dòng chức năng (functional cloning). Theo hướng này, thông tin về chức năng của gen được khai thác để phân lập gen mong muốn từ thư viện. Một oligonucleotide có trình tự dựa trên chuỗi amino acid từng phần được dùng như là một probe (mẫu dò) để phân lập dòng cDNA bằng cách sàng lọc thư viện cDNA. Dòng cDNA này sau đó có thể được dùng để sàng lọc thư viện genome nhằm phân lập các dòng genomic DNA và cho phép khảo sát đặc điểm của chuỗi genomic hoàn chỉnh.