Bảng 1.1. Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một sốn ước châ uÁ
vịt DP-EG-2000 trên phôi gà
tả vịt DP-EG-2000.
2.1.2. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy virus 2.1.3. Hoàn thiện quy trình kiểm nghiệm vacxin
- Kiểm tra vô trùng - Kiểm tra an toàn - Kiểm tra hiệu lực
- Xác ñịnh khả năng ñáp ứng miễn dịch của vịt sau khi ñược tiêm vacxin.
2.1.4. Ứng dụng vacxin trong phòng bệnh và can thiệp dịch
2.2. Nguyên liệu
2.2.1. Giống virus
- Chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 thích nghi trên phôi gà. - Chủng virus cường ñộc dịch tả vịt VG-04 ñược phân lập ở Việt Nam Hai chủng virus ñều do Bộ môn VSV-TN Khoa Thú Y trường ðại học Nông nghiệp Hà nội cung cấp.
2.2.2. Phôi gà
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 40
2.2.3. ðộng vật thí nghiệm
- Vịt từ 15-21 ngày tuổi, sinh ra từñàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh, chưa tiêm phòng vacxin dịch tả vịt. Vịt nuôi trong ñiều kiện thí nghiệm ñể xác ñịnh một số chỉ tiêu nghiên cứu cần thiết.
- Vịt tại các cơ sở chăn nuôi ñịa phương.
2.2.4. Dụng cụ và hoá chất phòng thí nghiệm
Tủấm 370C, tủ sấy khô, nồi hấp cao áp, tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu - 860C, máy ly tâm, buồng cấy vô trùng, dụng cụ làm tiêu bản vi thể và các dụng cụ
thường quy khác trong phòng thí nghiệm. Các trang thiết bị và hoá chất chuyên dụng cho phản ứng PCR.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác ñịnh khả năng thích ứng và ổn ñịnh của chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà
- Chuẩn bị trứng: Trứng gà có phôi 9 ngày tuổi, soi trứng, chọn những phôi khoẻ mạnh, ñánh dấu buồng hơi, ñánh dấu vị trí ñầu phôi, sát trùng bằng cồn 700 xung quanh vỏ trứng, sát trùng vị trí buồng hơi bằng cồn Iod 5%.
- Chuẩn bị giống virus vacxin: Giống virus vacxin khi dùng ñem pha với nước muối sinh lý 0,9% thành huyễn dịch 10-2.
- Bố trí thí nghiệm: Mỗi lần cấy truyền dùng 30 phôi, virus ñược tiêm vào xoang niệu mô, mỗi phôi ñược tiêm 0,2 ml. Trong mỗi lần cấy truyền sử
dụng 5 phôi làm ñối chứng, không tiêm virus.
- Tiến hành: Sau khi sát trùng vỏ trứng, dùng dùi ñục vô trùng ñục 1 lỗ
trên ñỉnh buồng hơi; sử dụng seringer 1 ml ñể tiêm. Khi tiêm ñưa kim qua lỗ ñã dùi chếch một góc 450 sâu 1,5-2 cm, ñầu kim hướng về phía ñầu phôi, rồi bơm 0,2 ml giống virus vacxin ñã pha. Lấy paraphin gắn kín lỗ tiêm lại, ñể
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 41 trứng nằm trên khay trứng và cho vào tủấm 370C ấp tiếp.
Sau các khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ kiểm tra xem thai trứng còn sống hay chết. Nếu thai chết, cho vào tủ lạnh 40C trong 12 giờ ñể mạch máu co nhỏ lại tránh xuất huyết, rồi mổ trứng, thu nước trứng và kiểm tra bệnh tích của phôi. Những phôi làm ñối chứng không tiêm virus vacxin và cũng cho vào tủ ấm ấp. Theo dõi cùng với phôi thí nghiệm ở các khoảng thời gian từ 24 → 96 giờ rồi ñánh giá kết quả.
2.3.2. Phương pháp xác ñịnh chỉ số ELD50 (liều gây chết 50% phôi) của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000
- Chuẩn bị trứng: Như phần 2.3.1.
- Tiến hành: Thí nghiệm ñược tiến hành 2 lần, mỗi lần pha giống virus vacxin với nước sinh lý thành 8 ñộ pha loãng từ 10-1 ñến 10-8. Mỗi ñộ pha loãng tiêm cho 5 phôi, mỗi phôi tiêm 0,2 ml.
Sau khi tiêm, theo dõi phôi ở các thời ñiểm từ 24 giờ ñến 96 giờ. Xác
ñịnh tổng số phôi chết và tổng số phôi sống ở từng ñộ pha loãng. Tính tỷ lệ
phôi chết theo công thức:
Tỷ lệ phôi chết (%)= Tổng số phôi chTổng sếốt + T phôi chổng sếốt phôi sống x 100 Áp dụng công thức tính ELD50 của Reed Muench
Lg ELD50 = lgA + X lgf X = A’ - B’ 50 - A’ Trong ñó: X: Khoảng cách cân ñối
A: ðộ pha loãng virus gây chết cận trên 50% A’: Tỷ lệ % phôi chết cận trên 50%
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 42 f: Bậc pha loãng của virus
2.3.3. Phương pháp xác ñịnh chỉ số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi) của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000
- Chuẩn bị trứng: Như phần 2.3.1.
- Tiến hành: Thí nghiệm ñược tiến hàh 2 lần, mỗi lần pha giống virus vacxin với nước sinh lý thành 8 ñộ pha loãng từ 10-1 ñến 10-8. Mỗi ñộ pha loãng tiêm cho 5 phôi, mỗi phôi tiêm 0,2 ml. Sau khi tiêm, theo dõi phôi ở các thời ñiểm từ 24 ñến 96 giờ. Kiểm tra và cho những thai chết vào tủ lạnh 40C trong 24 giờ. Sau 96 giờ cho toàn bộ trứng vào tủ lạnh 40C trong 24 giờ. Mổ
trứng, gắp phôi ra ñĩa lồng và kiểm tra bệnh tích của phôi (kể cả phôi sống sau 96 giờ). Xác ñịnh tổng số phôi có bệnh tích (phôi nhiễm) và tổng số phôi không có bệnh tích (phôi không nhiễm) ở từng nồng ñộ. Tính tỷ lệ phôi nhiễm theo công thức:
Tỷ lệ phơi nhiễm (%)= Tổng số phôi nhiTổễng sm + Tố phôi nhiổng số phôi không nhiễm ễm x 100 Tính EID50 theo công thức của Reed Muench
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất working seed
ðể hoàn thiện quy trình nhân giữ giống gốc và giống sản xuất , chúng tôi
ñã bố trí thí nghiệm như sau: Từ giống gốc ban ñầu (masterseed) ñem sản xuất ra giống workingseed ñời thứ I) rồi ñem workingseed ñời thứ I kiểm tra các chỉ tiêu về giống vi sinh vật ñảm bảo ñược yêu cầu ñể sản xuất vacxin . Khi giống workingseed ñời thứ I ñạt yêu cầu, tiếp tục nhân giống tạo workingseed ñời thứ II), rồi lại tiếp tục kiểm tra các chỉ tiêu về giống vi sinh vật nếu ñảm bảo yêu cầu sẽ tiến hành nhân tiếp. Cứ thế sản xuất ra vacxin workingseed các ñời tiếp theo và kiểm tra các chỉ số sinh học cho tới khi thấy chỉ số sinh học có dao ñộng, không còn giữ ñược tính ổn ñịnh về giống vi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 43 sinh vật sản xuất vacxin nữa thì dừng lại. Các chỉ tiêu kiểm tra chủ yếu là xác
ñịnh các chỉ số sinh học EID50; ELD50 .
2.3.5. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng
Sản xuất các lô vacxin, tập trung vào bình lớn, xử lý kháng sinh theo liều quy ñịnh, tiến hành kiểm tra vô trùng bằng cách lấy 0,2 ml vacxin cho vào một ống môi trường, mỗi loại môi trường dùng 3 ống. Sau khi cấy hỗn dịch vacxin ñã sản xuất trong phòng thí nghiệm vào các môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, nước thịt gan yếm khí ñể ở tủ ấm 370C 1-2 ngày kiểm tra vi khuẩn mọc. Riêng môi trường thạch nấm ñểở nhiệt ñộ phòng từ 5 -7 ngày kiểm tra nấm. Vacxin phải ñảm bảo vô trùng và không có nấm.
Kiểm tra tạp nhiễm virus viêm gan vịt: Tiêm vào dưới da cho 5 vịt 1 ngày tuổi khoẻ mạnh, không có kháng thể thụ ñộng viêm gan vịt và dịch tả
vịt, mỗi con 10 liều vacxin sử dụng. Theo dõi trong 14 ngày, tất cả vịt phải sống khoẻ mạnh. Nếu có virus viêm gan vịt cường ñộc thì vịt sẽ chết với triệu chứng ñặc trưng của bệnh viêm gan vịt.
2.3.6. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Sử dụng vịt ở các lứa tuổi, khoẻ mạnh, không nằm trong ổ dịch, chưa tiêm ph>ng vacxin dịch tả vịt. Tiến hành tiêm vacxin cho vịt với liều tiêm gấp 10 lần và 20 lần liều sử dụng (103EID50). Sau khi tiêm, theo dõi ñàn vịt 10 ngày. Vacxin ñược coi là an toàn khi sử dụng cho cơ thể chưa mắc bệnh phải
ñạt các yêu cầu sau: Con vật không có phản ứng phụ, không sốt hoặc chỉ sốt nhẹ, ăn uống và hoạt ñộng bình thường, không ảnh hưởng ñến khả năng sinh sản và sức sản xuất.
2.3.7. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực
Sử dụng phương pháp công cường ñộc ñể kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin. Dùng vịt 15 ngày tuổi và vịt nuôi ngoài thực ñịa, khoẻ mạnh, không
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 44 nằm trong ổ dịch, chưa tiêm phòng vacxin dịch tả vịt. Chia vịt thành 2 lô:
- Lô thí nghiệm: tiêm vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 với