2.2.1 Thiết bị
1. Thiết bị chiết siêu âm Ultrasonic cleaner ( Hàn Quốc ), tại Bộ môn Hóa hữu cơ, khoa hóa học, Trường ĐHSP Hà nội.
3. Máy đông cô chân không Labconco, tại Bộ môn Hóa học hữu cơ, khoa Hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội.
4. Thiết bị đo điểm chảy GallenKamp tại Bộ môn Hóa học hữu cơ, khoa hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội.
5. Thiết bị máy HPLC điều chế của Bộ môn Hóa học hữu cơ, khoa hóa học, Trường ĐHSP Hà nội.
6. Thiết bị đo cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance 500MHz của Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 7. Thiết bị đo phổ hồng ngoại Shimadzu 8101M FTIR của Viện hóa
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.2. Hóa chất
- Dung môi: Metanol, n- hexan, clorofom, etylaxetat, metanol, etanol. - Thuốc thử: Dragendoff, Mayer, Wagner, Liebermann – Burchard… và các hóa chất: dung dịch H2SO4đặc, dung dịch H2SO4 5%, dung dịch NaOH 10%, dung dịch CH3COOH 5%, dung dịch HCl đặc, dung dịch FeCl3,…
- Thuốc hiện hình: vanilin trong H2SO4 10%
2.2.3. Dụng cụ
- Sắc ký cột, chất hấp thụ silicagel( hãng Merck-60), kích thước hạt 40- 60, với hệ dung môi rửa giải là n- hexan:etylaxetat tăng dần độ phân cực.
- Sắc ký bản mỏng: sử dụng bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel F-254 (hãng Merck).
- Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm.
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết tách
a. Thu hái
Củ Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis được thu hái tại tỉnh Attapeu, CHDCND Lào, tháng 11/2012.
b. Xử lí mẫu - Sấy mẫu:
Củ Bách Bộ thân đứng được đem sấy nhanh ở 110oC trong vòng 50 giây để diệt mầm nấm men, sau đó sấy khô ở 60-70oC (có thể phơi dưới ánh nắng mặt trời ), sau đó thái nhỏ.
- Ngâm chiết mẫu:
Lấy 3,1 kg mẫu củ Bách Bộ thân đứng đem ngâm chiết liên tục bằng hỗn hợp metanol: nước theo tỉ lệ 9:1 khoảng 3 tuần. Lọc để thu lấy dung dịch có màu vàng cam. Phần bã còn lại đem ngâm lại trong metanol: nước. Tiến hành tương tự như thế 7 lần. Thu lấy tất cả các dung dịch lọc được đem cất cô quay chân không để cất đuổi dung môi thu được cao tổng.
Mặt khác, chúng tôi tiến hành ngâm chiết 3,1 kg củ Bách Bộ thân đứng trong metanol, chiết siêu âm liên tục. Sau 3 tuần lọc để thu lấy dung dịch có màu vàng cam. Phần bã còn lại đem ngâm lại trong metanol. Tiến hành tương tự như thế 7 lần. Thu lấy tất cả các dung dịch lọc được đem cất cô quay chân không để cất đuổi dung môi thu được cao tổng.
Để phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ cao tổng thu được ở trên chúng tôi sử dụng qui trình chiết bằng phễu chiết thực hiện ở điều kiện nhiệt độ phòng. Đó là qui trình chiết phân đoạn bằng các dung môi n-hexan, etyl axetat và metanol. Qui trình chiết như sau:
+ Lấy cao tổng hòa trong n-hexan, dùng phễu chiết để chiết lấy dịch n- hexan. Phần bã còn lại tiếp tục chiết với n-hexan tương tự như thế thêm 2 lần. Dịch chiết n-hexan qua 3 lần chiết được gom lại. Phần bã còn lại gọi là bã 1.
+ Tiếp tục chiết bã 1 bằng etyl axetat. Làm 3 lần sau đó gom dịch chiết etyl axetat vào. Phần bã còn lại sau khi chiết etylaxetat gọi là bã 2.
+ Phần bã 2 đem chiết 3 lần bằng metanol. Làm 3 lần sau đó gom dịch chiết metanol.
Các dịch chiết thu được đều có màu nâu sẫm. Sau khi cất đuổi dung môi thu được các cặn chiết tương ứng: cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặn metanol.
Dưới đây là khối lượng các cặn chiết thu được và hàm lượng % các cặn chiết:
Bảng 2.1. Hàm lượng % các cặn chiết so với mẫu khô
STT Tên cặn chiết Số gam thu được % so với mẫu khô
1 Cao tổng 138,8 g 4,48%
2 Cặn n-hexan 49,355 g 1,59%
3 Cặn etyl axetat 39,51 1,27%
2.3.2. Sơ đồ thực nghiệm
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết lấy cặn etyl axetat từ củ Bách Bộ thân đứng
2.3.3. Thử định tính các chất bằng sắc kí bản mỏng
1.Etylaxetat
2.cất đuổi dung môi Lọc Dung dịch Bã Cặn Metanol Cặn n-hexan EtylaxetatCặn Cao tổng Củ Bách bộ thân đứng
Ngâm trong metanol trong 3 tuần
Cất cô quay
Chiết
Sấy khô ở 60-70oC
1.n –hexan
2.cất đuổi dung môi
1.Metanol
Kiểm tra định tính cặn etyl bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi n- hexan: etyl axetat = 4:1 thu được kết quả theo bảng sau:
Bảng 2.2. Kết quả sắc kí cột cặn chiết etyl axetat
Rf Màu sắc Hình dạng
0.56 Vàng chanh Vệt gần tròn
0.30 Xanh Vệt gần tròn
0.28 Vàng 3 Vệt gần tròn
2.3.4. Phân lập các chất từ cặn etyl axetat
* Nhồi cột (phương pháp nhồi ướt): Chọn cột phù hợp với khối lượng mẫu - Nhồi lượng bông phù hợp để chất theo dung môi ra từ từ và giữ lớp silicagen.
- Hòa silicagen bằng dung môi đã chọn, lượng silicagen phù hợp với lượng mẫu. Mở khóa thủy tinh , rửa liên tục bằng dung môi đã chọn, gõ nhẹ để silicagen xuống đều và cho bề mặt silicagen phẳng. Ổn định cột trong 6 giờ.
* Đưa chất lên cột:
- Mẫu phải cất kiệt dung môi, để đảm bảo độ phân cực của dung môi đã chọn không bị thay đổi khi cho mẫu vào.
- Hòa tan mẫu khô kiệt trong hệ dung môi đã chọn (lượng dung môi nhỏ nhất có thể). Cho lượng silica gel Meck vào để hấp phụ chất, đảm bảo phải tạo thành các hạt khô đều, không dính nhau, lượng silicagen sử dụng để tẩm mẫu chỉ vừa đủ.
- Dùng phễu cho silica gel đã tẩm mẫu vào thật nhẹ nhàng, gõ nhẹ cho chất xuống đều, tạo thành 1 lớp phẳng.
- Cho một lớp bông nhỏ để trên cùng, tránh ảnh hưởng khuấy trộn khi cho thêm dung môi lên cột.
- Chú ý: không được làm cột bị khô, mất sự bằng phẳng của bề mặt chất và của lớp silica gel.
* Chọn hệ dung môi:
Cột sắc kí được rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan: etyl axetat với tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 4:1 đến 1:10. Sau đây là kết quả thu được khi chạy phân lập các cấu tử từ cặn etyl axetat:
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các cấu tử từ cặn etyl axetat
Khi chạy cột thô bằng hệ dung môi n- hexan: etylaxetat với tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 4:1 đến 1:10, chúng tôi thu được 14 phân đoạn (từ H1 đến H14),trong đó có 4 phân đoạn thu được kết tinh là: H1, H3 (thu được từ phân đoạn n-H: E= 4:1) và H6, H11 (thu được từ phân đoạn n-H: E= 1:1). Sau khi lọc và rửa các kết tinh, chúng tôi thu được 4 chất sạch có ký hiệu là H1, H3,
Củ Bách bộ thân đứng Dung dịch Cao tổng Cặn Etylaxetat Cặn metanol Cặn n-hexan metanol n- hexan: etylaxetat H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 n- hexan: etylaxetat H9.3
H6, H11 với khối lượng lần lượt là H1(25mg), H3(30mg), H6(20mg), H11(20mg).
Với phân đoạn H9 có khối lượng 125mg, chúng tôi thấy có sự tách tốt nên đã tiến hành chạy cột tinh cũng với tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 4:1 đến 1:10 của hệ dung môi n- hexan: etylaxetat, chúng tôi thu được 1 phân đoạn kết tinh là H9.3 (n-H: E= 4:1). Sau khi lọc và rửa kết tinh,chúng tôi thu được chất sạch H9.3 có khối lượng 2mg.
2.4. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 2.4.1. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy
Các chất sạch H1, H3, H6, H11 và H9.3 sau khi rửa sạch và sấy khô, lấy một lượng nhỏ đo nhiệt độ nóng chảy bằng thiết bị đo điểm chảy Gallen Kampf tại Bộ môn Hóa học hữu cơ, Khoa hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội.
2.4.2. Phương pháp phổ IR, MS, EI-MS, NMR
Các chất sạch H1, H3, H6, H11 và H9.3 sau khi rửa sạch và sấy khô, lấy một lượng nhỏ đo các phổ IR, NMR bằng các thiết bị như đã nêu ở mục 2.2.1. Phân tích hợp chất phân lập được.
2.5. Đặc trưng vật lý phổ của các chất phân lập được2.5.1.Hợp chất H1 2.5.1.Hợp chất H1
- Nhiệt độ nóng chảy: 155 - 157OC
- Tinh thể màu trắng, hình kim, không phát quang dưới đèn tử ngoại , hiện màu với vanilin/H2SO4, dễ tan trong metanol, etanol, clorofom.
- Phổ 1H NMR: Xem bảng 3.1 và Phụ lục 1.
2.5.2.Hợp chất H3
- Chất không màu, kết tinh hình kim. Tan tốt trong clorofom. - Nhiệt độ nóng chảy: 113-114oC
- Phổ IR của chất H3 có 1 vân hấp thụ cường độ lớn tại bước sóng 3380 cm-1, đặc trưng của dao động hóa trị nhóm –OH. Ngoài ra, còn một số dao
động hóa trị của =C-H ở 3074 cm-1, dao động của liên kết đôi >C=C< ở 1642 cm-1 và dao động của nhóm metoxy ở 3369 cm-1.
- Phổ 1H NMR và 13C NMR, HSQC: xem bảng 3.2 và Phụ lục 2-4.
2.5.3.Hợp chất H6
- Tinh thể hình kim màu trắng, tan tốt trong clorofom, methanol. - Nhiệt độ nóng chảy: 140- 145oC
- Phổ IR (ν , cm-1): 3380 (OH), 3074 (=CH), 1642 (C=C).
- Phổ 1H NMR và 13C NMR, HSQC: xem bảng 3.3 và Phụ lục 5-7.
2.5.4. Hợp chất H11
- Tinh thể màu trắng, hình kim, phát quang màu sáng vàng chanh dưới ánh sáng tử ngoại (λ=254nm), không hiện màu với vanilin/H2SO4, dễ tan trong metanol, etanol, clorofom.
- Nhiệt độ nóng chảy: 205-207 oC.
- Phổ IR (ν, cm-1): 3413 (tù, OH hoặc N-H) , 2939, 2869 (CH2 no, CH3), 1767 (mạnh, -CO-O-), 1655 (C=C liên hợp), 1328 (=C-O-C).
- Phổ 1H NMR và 13C NMR, HSQC: xem bảng 3.4 và Phụ lục 8-10.
2.5.5. Hợp chất H9.3
- Kết tinh hình kim, màu trắng, tan tốt trong dung môi clorofom - Phổ 1H NMR: xem bảng 3.5 và Phụ lục 11.
2.6. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
Dưới đây là phương pháp thử nghiệm khả năng kháng nấm, kháng khuẩn kiểm định. Các thử nghiệm được tiến hành tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: Bacillus subtilis (ATCC 6633), Staphylococcus aureus
(ATCC 13709), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa
(Lp B14), Enterococcus faecium (B650). Mô trường nuôi cấy: MHB (Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth), TSA ( Tryptic Soy Agar ) cho vi khuẩn; SAB, SA cho nấm.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%), MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
* Pha loãng mẫu thử: Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và
nước cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 µg/ml, tiếp theo là 32 µg/ml, 8µg/ml, 2µg/ml, 0,5µg/ml.
* Thử hoạt tính: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ
5.105CFU/ml khi tiến hành thử.
- Lấy 10µl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm 200µl dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37oC. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
* Chất tham khảo: Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram
(+) và chủng E.c với giá trị IC50 trong khoảng 0,05-2µg/ml.Kháng sinh Pen/Step cho chủng Pa với giá trị IC50 trong khoảng 4-5µg/ml. Amphotericin B cho vi nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5-1 µg/ml.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất tinh sạch
3.1.1 Hợp chất H1
Hợp chất H1 (25mg) kết tinh hình kim, màu trắng, to
nc = 155-157 oC, tan tốt trong clorofom, methanol. Phổ IR của hợp chất H1 có 1 vân hấp thụ mạnh, tù ở bước sóng 3456 cm-1 được gán cho dao động hóa trị của nhóm OH. Phổ ESI-MS của H1 cho 1 pic ion phân tử với số khối m/z = 412, tương ứng với công thức phân tử C29H48O.
Phổ 1H NMR của H1 có 48 proton phân bổ chủ yếu ở vùng trường cao, khá đặc trưng cho steroit. Trong đó H1 có 3 proton olefinic phân bố ở vùng trường trung bình (δH 5,35 5,15 5,02 ppm), 1 proton cacbinolic (-CHOH, δH
3,53 ppm), còn lại là các proton trong khung steroit.
Hình 3.1. Phổ 1H NMR của hợp chất H1
So sánh các giá trị phổ của H1 với của stigmasta-5,22-dien-3β-ol từ tài liệu tham khảo [16] chúng tôi thấy có sự trùng khớp tốt, vì vậy có thể kết luận rằng hợp chất H1 chính là stigmasta-5,22-dien-3β-ol. CH no (khung steroit) H-3 H-6 H-22 H-23
HO 1 2 3 6 8 9 11 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 H1 (Stigmasta-5,22-dien-3β-ol)
Bảng 3.1. Một số giá trị phổ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) đặc trưng của hợp chất H1 so sánh với của stigmasta-5,22-dien-3β-ol [16]
STT H1 Stigmasta-5,22-dien-3β-ol 3 3,53 m 3,35 m 6 5,35 m 5,35 brd 5,1 22 5,15 dd 9,0 15,5 5,15 dd 23 5,02 dd 9,0 15,5 5,02 dd 3.1.2. Hợp chất H3
Hợp chất H3 (30 mg) kết tinh hình kim, màu trắng, to
nc = 113- 114oC, tan tốt trong clorofom. Phổ ESI-MS ion dương cho pic [M+Na]+ tại m/z 323, kết hợp với các dữ kiện phổ NMR cho phép dự đoán công thức phân tử của hợp chất H3 là C18H20O4.
Phổ IR của chất H3 có 1 vân hấp thụ cường độ lớn tại bước sóng 3380 cm-1, đặc trưng của dao động hóa trị nhóm –OH. Ngoài ra, còn một số dao động hóa trị của =C-H ở 3074 cm-1, dao động của liên kết đôi >C=C< ở 1642 cm-1 và dao động của nhóm metoxy ở 3369 cm-1.
Phổ 1H NMR của chất H3 có tổng cộng 20 proton, trong đó có 6 proton từ hai nhóm CH3O với các giá trị δH 3,50 (3H, s) và 3,81 (3H, s), hai nhóm CH3 với δH 2,21 (3H, s) và 2,24 (3H, s). Ngoài ra, 4 proton cộng hưởng ở vùng trường cao tại δH 2,69 (2H, m), 2,77 (2H, m) được gán cho 4 proton của
hai nhóm CH2 liền kề, liên kết với vòng thơm. Cuối cùng, hai proton với δH
6,85 (1H, d, J=9,0Hz) và 8,01 (1H, d, J=9,0Hz) được gán cho 2 proton thơm của cùng vòng benzene, nằm ở vị trí octo- đối với nhau, do hằng số tương tác
J lớn, trùng nhau.
Hình 3.2. Phổ 1H NMR của hợp chất H3
Phổ 13C NMR của hợp chất H3 có cả thảy 18 cacbon. Trong đó có 2 cacbon từ nhóm metyl với δc 8,9 (4’-Me) và 11,8 (2’-Me), 2 cacbon từ hai nhóm metoxy với δc 59,9 (5’-OMe) và 61,4 (2-OMe); 2 cacbon từ hai nhóm CH2 với δc 25,5 (C-1”) và 22,2 (C-2”). Mười hai cacbon còn lại có các giá trị
δc dao động từ 113,0 đến 154,5 ppm được gán cho 12 cacbon của hai vòng benzen, trong đó có 4 cacbon thơm liên kết trực tiếp với OH hoặc OCH3 nên cộng hưởng ở vùng trường yếu hơn (δc 143,2-154,5 ppm).
So sánh các giá trị phổ NMR của chất H3 với của stemanthrene C từ tài liệu tham khảo [18], chúng tôi thấy có sự trùng khớp tốt, vì vậy có thể kết luận rằng hợp chất H3 chính là stemanthrene C. Hợp chất này cũng đã được NCS.Vong Anatha Khamko phân lập từ củ Bách Bộ thân đứng Stemona
5’-OCH3 2’-CH3 H-2” H-1” HO-Ar H-5 H-4 4’-CH 3 2-OCH3
H3CO HO CH3 OH CH3 H3CO 1" 2" 1 2 4 1' 2' 4' H3 (Stemanthrene C)
Bảng 3.2. Các giá trị phổ 1H và 13C NMR của H3, so sánh với của stemanthrene C [18] STT 1H NMR (CDCl3) 13C NMR (CDCl3) H3 Stemanthrene C H3 Stem.C 1 - - 130.5 130.5 2 - - 143.2 143.2 3 - - 146.9 146.9 4 6.85 d, J= 9.0,1H 6.85 d, J= 8.5, 1H 113.0 113.0 5 8.01 d, J= 9.0,1H 8.01 d, J= 8.5, 1H 124.3 124.3 6 - - 126.6 126.6 1’ - - 136.1 136.1 2’ - - 116.2 116.2