khuẩn bị chia nhỏ và bắt đầu tự phân.
Những giống sinh streptomycin rất không ổn định. Do đó, trong tương lai cần có sự can thiệp của kỹ thuật di truyền để tạo ra những giống có hoạt
khoảng năm năm có thể còn 96-99% hoạt lực, trong cát thạch anh tới ba
năm, trên môi trường thạch nước đậu ở 5oC tới một năm. Các nguồn carbon
mà giống Streptomyces có thể đồng hóa được và sinh kháng sinh là glucose, tinh bột, dextrin, maltose, fructose, galactose, manose. Trong thực tế, glucose và tinh bột được dùng làm nguồn nguyên liệu trong sản xuất streptomycin.
▪ Phương pháp sản xuất streptomycin
Lên men streptomycin được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy chìm. Quá trình lên men này cũng giống như lên men các loại kháng sinh khác, bao gồm các giai đoạn: Nhân giống và lên men chính.
- Nhân giống.Giống xạ khuẩn được bảo quản ở dạng bào tử. Cấy bào tử vào môi trường nhân giống trong bình tam giác lắc 180-220 vòng/phút ở 26-28oC/30-70 giờ, sau đó cho tiếp vào các bình nhân giống (có sục khí và khuấy), nuôi tiếp cho phát triển sinh khối 20-40 giờ. Nhiệm vụ chính trong giai đoạn nhân giống là tạo ra một khối lượng lớn khuẩn ty xạ khuẩn ưa kiềm có khả năng phát triển mạnh trong giai đoạn lên men chính và tạo thành một lượng lớn kháng sinh.
- Lên men. Lên men streptomycin là quá trình lên men hai pha điển hình. Nhiệt độ lên men khoảng 26-28oC, thời gian lên men 96 giờ. Trong thời gian lên men cần phải thông khí và khuấy trộn môi trường. Lượng không khí thổi qua môi trường trung bình là 1 thể tích khí/1 thể tích môi trường. Khuấy trộn môi trường liên tục trong suốt cả quá trình lên men (kể cả khi nhân giống) nếu ngừng khuấy chỉ trong một thời gian ngắn sẽ làm giảm hiệu suất streptomycin. Độ pH trong những giờ đầu có giảm chút ít sau đó tăng dần.
3.3. Tetracycline
Tetracycline là một dãy các chất kháng sinh có cùng một nhân chung tetracycline (ví dụ: tetracycline, chlotetracycline, oxytetracycline, dimethyltetracycline…) và một số nhóm chung có trong phân tử (ví dụ
nhóm dimethylamino -N(CH3)2, nhóm amide CONH2…). Tetracycline được
dùng rộng rãi trong y học và thú y. Tetracycline có thể được sản xuất bằng lên men xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens. Tetracycline được tìm thấy vào năm 1953 bằng cách khử halogen trong phân tử chlotetracycline. Lúc đầu phương pháp này được dùng trong công nghiệp nhưng giá thành sản
phẩm rất đắt, sau đó người ta tìm thấy chất kháng sinh này có trong dịch nuôi cấy xạ khuẩn sinh chlotetracycline là Strep. aureofaciens.
Giống xạ khuẩn có khả năng tổng hợp tetracycline và chlotetracycline là Strep. aureofaciens, còn giống sinh oxytetracycline là Strep. rimosus. Nguồn carbon dùng trong nuôi cấy Strep. aureofaciens là glucose (tích tụ nhiều tetracycline), còn Strep. rimosus cho nhiều oxytetracycline trên môi trường maltose.
Trong quá trình lên men, ở pha thứ nhất các chất dinh dưỡng tiêu hao nhanh. Trong khoảng 24-48 giờ nuôi cấy khối khuẩn ty đã được 70-80% mức tối đa và 60-80% các chất dinh dưỡng đã được sử dụng. Bước sang pha lên men thứ hai các giống xạ khuẩn này đều phát triển chậm lại, tốc độ sử dụng các chất dinh dưỡng giảm đi rất nhiều, phát triển khuẩn ty chậm lại dần, đạt tới mức độ cực đại và ổn định rồi bước vào giai đoạn tự phân. Kháng sinh tích tụ tối đa ở 110-120 giờ.
▪ Phương pháp sản xuất tetracycline
Lên men tetracycline (tetracycline, chlotetracycline, oxytetracycline, dimethyltetracycline…) theo phương pháp nuôi cấy chìm. Quá trình lên men ở đây giống như lên men các chế phẩm khác, bao gồm các giai đoạn: nhân giống và lên men.
- Xạ khuẩn Strep. aureofaciens dùng trong lên men tetracycline và chlotetracycline hoặc các halogentetracycline khác. Cấy bào tử vào môi trường nhân giống trong bình tam giác pH 6,8-7,0 lắc 220-250 vòng/phút khoảng 24-40 giờ. Sau đó, được tiếp tục nhân giống trong nồi nhỏ rồi chuyển vào môi trường lên men. Lên men tetracycline và chlotetracycline là lên men hai pha điển hình.
- Giống Strep. rimosus được nhân giống ở bình tam giác lắc 220-250
vòng/phút ở 27-28o
C/48-72 giờ, sau đó nhân tiếp tục trong nồi có sục khí và khuấy rồi chuyển sang môi trường lên men có điều kiện tương tự nhưng kéo dài từ 5-7 ngày.
4. Sản xuất acid hữu cơ
4.1. Acetic acid
thực phẩm, ướp chua rau quả. Quá trình lên men nhờ vi khuẩn acetic oxy hóa rượu ethanol thành acetic acid (Hình 3.10).
Có trên 20 loài vi khuẩn có khả năng lên men acetic, chúng được gọi một tên chung là vi khuẩn acetic. Trong môi trường đủ rượu ethanol (5- 13%) thì sản phẩm chủ yếu là acetic acid, nếu nồng độ rượu thấp hơn các vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa triệt để rượu thành CO2 và H2O.
Vi khuẩn acetic là bọn ưa ấm và rất hiếu khí, có tốc độ sinh trưởng rất nhanh từ một tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 12 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng tạo thành acetic acid và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng. Vì vậy, trong sản xuất dấm có thể dùng rượu không cần vô trùng được bổ sung một ít acetic để acid hóa môi trường, nhiệt độ lên men khoảng 25-32oC và sục khí mạnh.
Hình 3.10. Quá trình lên men acetic acid
Các loài vi khuẩn acetic có giá trị như: Acetobacter aceti, Ace. pasteurianum, Ace. orleaneuse, Ace. xylium, Ace. schiitzenbachii, Ace. curvum, Ace. suboxydans.
Nguồn cơ chất chủ yếu trong lên men acetic là ethanol có bổ sung thêm một ít đường, nguồn nitrogen vô cơ hoặc hữu cơ, và một số chất khoáng khác. Có ba phương pháp lên men acetic: (1) Phương pháp chậm còn gọi là phương pháp Orlean hoặc phương pháp Pháp, dùng nước hoa quả
làm nguyên liệu với vi khuẩn Ace. orleaneuse. (2) Phương pháp nhanh còn
gọi là phương pháp Đức, phương pháp này được áp dụng chủ yếu trong
Alcohol-dehydrogenase CH3CH2OH CH3CHO + 2H (Ethanol) (Acetaldehyde) OH CH3 CH CH3COOH + 2H (Acetic acid) OH (Acetaldehyde) Aldehyde-dehydrogenase
công nghiệp sản xuất dấm ăn trên thế giới, vi khuẩn được sử dụng là Ace. schiitzenbachii hoặc Ace. curvum. (3) Phương pháp lên men chìm, đây là kiểu lên men bán liên tục sử dụng các chủng vi khuẩn của loài Ace. suboxydans.
4.2. Citric acid
Citric acid hay limonic acid (C6H8O7) có nhiều trong thiên nhiên, đặc biệt trong các loài cây ăn quả có múi (họ cam chanh-Rutaceae) được dùng chủ yếu trong chế biến thực phẩm và dược phẩm. Citric acid cũng có thể được sản xuất ở quy mô công nghiệp bằng phương pháp lên men, nấm mốc sẽ chuyển hóa đường thành citric acid.
Cơ chế sinh tổng hợp citric acid ở vi sinh vật có thể biểu diễn bằng phương trình tổng quát như sau:
2C6H12O6 + 3O2→ 2C6H8O7 + 4H2O
Các nấm mốc sinh citric acid hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho phát triển và lên men là 30-32oC. Nguồn carbon tốt nhất đối với Asper. niger là saccharose, còn đối với Citromyces là maltose. Nồng độ đường trong môi trường 10-20% là thích hợp hơn cả. Các nguồn nitrogen vô cơ dùng trong lên men citric acid tốt nhất là nitrate còn nitrogen hữu cơ là nước chiết đậu nành. Trong môi trường lên men cần chú ý các nguyên tố khoáng P, Mg, K, Fe và Zn.
Có hai phương pháp được dùng để sản xuất citric acid là lên men bề mặt (trên môi trường lỏng hoặc rắn) và lên men chìm.