V. Phương pháp xác định hoạtđộ
3. Xác định hoạtđộ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase )
a/ Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase cĩ trong chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH= 4,7 ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ giải phĩng được 1 mg glucose.
b/ Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase cĩ trongdịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệucủa Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH = 4,7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phĩng được 1 µmol glucose.
4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase cĩ hoạt lực cao
a) Chủng giống vi sinh vật:
Muốn nhận chế phẩm Amylase cĩ hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng, giống nào cĩ khả năng tích tụ nhiều Amylase.
Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã cĩ được điều kiện cần thiết để tạo ra chếphẩm Amylase cĩ hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ cĩ tính chất tương đối với thời gian vàđiều kiện nhất định nào đĩ. Lồi người luơn tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới cĩ hoạtlực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy gen
Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 cĩ hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu.
b)Mơi trường dinh dưỡng:
Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuơi cấy bề mặt trên canhtrường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là mơi trường tự nhiên tốt nhất để sinhtổng hợp Amylase.
KIL OB OO KS .CO M
Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tinh bột, 10 - 12% protit. Ngồi ra cịn chứa muối khống, các nguyên tố vi lượng, vitamin...
Để tiết kiệm cám người ta cịn trộn thêm các nguyên liệu khác vào mơi trường như trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia...
Ở nước ta do khơng cĩ cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột ngơ vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau.
Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase cĩ hoạt độ cao từAsp.awamori làcám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngơ 6% ( hàm lượng tinh bột 55% ) và 19% trấu.Hàm lượng tinh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuơi cấy là: to 32OC, độ ẩm 57% và nuơi trong 42 giờ.
Ngồi tinh bột, mơi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự cĩ mặt của glucose,fructose và saccarose cĩ tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sựtích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào mơi trường lỏng thì nấm mốc pháttriển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase.
Ngồi gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nĩi chung và nấm mốc nĩi riêng đềucần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ cĩ thể cĩ sẵn trong cám, bột ngơ, khi cần thiết cĩ thể bổsung thêm từ khơ lạc, khơ đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Theo kết quả nghiêncứu của giáo sư Phenicxơva, nấm mốcAsp.awamori cĩ thể phát triển tốt trong mơi trườngchứa 0,05% đạm vơ cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng nồng độ tới 0,15%; để tạoglucoamylase cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng cĩ tác dụng tốt đến sinhtrưởng và phát triển của nấm mốc nhưng ít cĩ hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme. Ví dụkhi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngơ vào canh trường thì việc tích tụ Enzyme vẫnthua kém so với nguồn đạm vơ cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm mầm vàocanh trường lại cĩ tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme.
Sự tạo thành và tích tụ Amylase cịn gắn với sự cĩ mặt của các ion Mg2+, Ca2+ vàphotpho, đặc biệt là magie. Trong mơi trường thiếu MgSO4, Amylase hầu như khơng đc tạothành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% - Sau magie là photpho, ion P đĩng vai trị quantrọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0,1 - 0,2%.
Canxi cĩ trong thành phần của α-Amylase. Một phân tử α-Amylase cĩ tới 2 hoặc 3 ioncanxi. Người ta cho rằng tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc số ion canxi cĩ trongphân tử; nhưng cũng cĩ ý kiến cho rằng tính bền nhiệt của Enzyme này cịn phụ thuộc vàothành phần acid amin, nhất là hàm lượng của acid glutamic.
KIL OB OO KS .CO M
Lưu huỳnh cũng đĩng vai trị quan trọng khơng kém. Hoạt độ Amylase gắn liền với sựcĩ mặt của nhĩm –SH; mặt khác cịn tham gia vào thành phần của acid amin cấu tạo thànhEnzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm bảo cho hoạt độAmylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt độ Amylase của Asp.orysee chỉ cịn 50% và bằng 180 đv/100m
Hoạt độ của một số chủng nuơi trên mơi trường cám lúa mì theo phương pháp bề mặt
(bảng t29) c) Điều kiện nuơi cấy
Chủng giống và mơi trường nuơi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đĩ ta cịn phải chú ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm:
• Nhiệt độ
Cần phải cĩ trang bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường. Bằng cáchquạt khơng khí lạnh và ẩm vào canh trường. Nếu nuơi cấy trong mơi trường lỏng thì cần làmlạnh đồng thời kết hợp với sục khí.
Nhiệt độ khơng khí trước khi đưa vào phịng nuơi phải vào khoảng 22 – 250C, cịn độ ẩm tương đối của khơng khí là 98 - 100%.
• Độ ẩm canh trường
Trong điều kiện vơ trùng ở phịng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu để nấm mốc phát triểnnằm trong giới hạn 65 - 70%. Trong thực tế sản xuất, mức độ vơ trùng khơng thể đạt đượcnhư trong phịng thí nghiệm nên người ta thường nuơi cấy trong canh trường cĩ độ ẩm thấphơn, nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi màđộ ẩm cĩ thể khống chế ở 50 - 60%. Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triểncủa tạp khuẩn, nhưng nấm mốc cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéodài thời gian. Do đĩ vấn đề cần đặt ra là phải bằng mọi biện pháp thực hiện tốt cơng việc vệsinh. Muốn vậy trước hết phải tiệt trùng mơi trường ở áp suất và thời gian thích hợp nhằm tiêudiệt các tế bào và bào tử vi sinh vật cĩ sẵn trong nguyên liệu dùng làm mơi trường.
Do trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm mốc thải ra một lượng nhiệt khá lớnnên canh trường bị nĩng và làm giảm độ ẩm. Đổ nước lạnh xuống nền và phun nước quanhtường sẽ gĩp phần giảm nhiệt và giúp cho canh trường đỡ bị khơ.
KIL OB OO KS .CO M
Khi nuơi cấy theo phương pháp bề mặt trên canh trường rắn, pH ít ảnh hưởng tới sinhtrưởng và phát triển của nấm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của mơi trường vào khoảng5,5 - 6,0. pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụEnzyme. Khi nuơi cấy trong mơi trường lỏng: pH ban đầu thường vào khoảng 6 - 7. Đối với Asp.orysee sau 3
ngày nuơi cấy pH giảm cịn 5,5 - 6,0. Ngược lại khi nuơi Asp.awamoriđể nhận glucoamylase, sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 - 7,8.
Thực tế pH cĩ ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, vì thế trong sản xuất người ta sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luơn trong giới hạn tối ưu.
• Cung cấp oxy
Trong quá trình phát triển và tích tụ Enzyme, nấm mốc rất cần oxy. Trong sản xuấtsinh học, sự phát triển của tế bào và tích tụ Enzyme cĩ liên quan mật thiết tới sự cĩ mặt của oxy.
Khi nuơi cấy theo phương pháp bề mặt, nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy của khơngkhí qua sợi nấm và mixen. Vì thế canh trường phải xốp, giúp cho nấm mốc tạo nhiều sợi vàtích tụ Enzyme. Nếu mơi trường dính bết, khơng khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra hơ hấp yếm khí,ảnh hưởng xấu đến tích tụ Enzyme. Vì vậy ở mỗi giai đoạn của sự phát triển, tùy vào lượngoxy cần cho quá trình trao đổi chất và lượng nhiệt nấm mốc tỏa ra mà điều chỉnh lượng khơngkhí vào phịng nuơi cho thích hợp.
Yêu cầu về lượng khơng khí và cung cấp oxy trong mơi trường lỏng cĩ những khácbiệt. Yêu cầu đặt ra là phải làm sao để oxy của khơng khí hịa tan vào canh trường càng nhiềucàng tốt. Trong canh trường lỏng tế bào nấm mốc phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc củachúng với oxy phải thơng qua canh trường – khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy cĩ thểhịa tan vào dung dịch. Lượng oxy hịa tan trong canh trường phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố:nhiệt độ, áp suất, cơng nghệ sục khí cũng như hàm lượng và tính chất của các chất hịa tan trong dung dịch.
C. Ứng dụng Enzyme Amylase
Amylase là nhĩm Enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: cơng nghệ sảnxuất rượu bia, cơng nghệ thực phẩm…đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất bia. Trong lĩnh vựcsản xuất bia Amylase được sử dụng để đường hĩa tinh bột thành maltose, glucose dùng làmcơ chất cho quá trình lên men bia. + Trong cơng nghiệp sản xuất rượu bia (giai đoạn đường hố tinh bột ) + Trong cơng nghiệp sản xuất tương , mạch nha , mật, đường glucose ….
KIL OB OO KS .CO M
+ Từ tinh bột cĩ thể làm cơm rượu làm thức ăn cho gia súc rất giàu chất dinh dưỡng
+ Amylase cịn được ứng dụng trong sản xuất làm bánh mì , làm cho bánh nở xốp thơm ngon hơn .
+ Trong cơng nghiệp dệt chế phẩm Enzyme Amylase cịn dùng để rũ hồ vải là tẩy lớp hồ bột trên mặt vải. Làm cho vải mềm mịn , dễ tẩy trắng dễ bắt màu khi nhuộm .
+ Trong cơng nghiệp chế biến dược phẩm + Trong cơng nghiệp sản xuất bột ngọt
I. Ứng dụng trong sản xuất Bia
Bia là loại đồ uống cĩ độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngồi việc cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia cịn chứa một hệ Enzyme khá phong phú, đặc biệt là nhĩm Enzyme kích thích tiêu hĩa
Nguyên liệu sử dụng : Ngũ cốc , hoa Houblon, nước , Nấm men, chất phụ gia Các chủng vi sinh vật sử dụng:
+ Saccharomyces cerevisisae ( Lên men nổi) + Saccharomyces cerevisidae (Lên men chìm)
Tinh bột là thành phần chiếm vị trí số một của hạt đại mạch cả về số lượng lẫn vai trịcủa nĩ trong sản xuất bia. Trong cơng nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng EnzymeAmylase cĩ trong mầm đại mạch.
Ngồi ra, cịn sử dụng các Enzyme khác cĩ trong mầm đại mạch để thủy phân vàchuyển hố các chất khơng tan sang trạng thái tan như chuyển protein, cellulose… sangamino acid và glucose .
Các quá trình cơng nghệ này đã được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. So với cácloại Enzyme Amylase từ các nguồn khác, Amylase từ thĩc đại mạch đã được nảy mầm đượcsử dụng với số lượng nhiều nhất hiện nay.
Quá trình hạt đại mạch nảy mầm là quá trình sinh tổng hợp Enzyme Amylase và nhiều Enzyme khác
Nhờ sự tổng hợp ra những Enzyme này, hạt tiến hành quá trình tự phân hủy tinh bột, protein và các hợp chất khác để cung cấp nguyên liệu và năng lượng cho hạt nảy mầm Enzyme Amylase tác động vào giai đoạn đường hĩa:
Biến đổi tinh bột đã qua giai đoạn dịch hĩa thành Dextrin và Maltose tác động tạo Dextrin hĩa,β - Amylase tác động tạo mantose.
KIL OB OO KS .CO M α -Amylase
Tinh bột → Dextrin + maltose + glucose Thủy phânα -1,4 của amylose
β -Amylase
Tinh bột → Maltose +β - Dextrin (Glucogen)
Trong gian đoạn lên men tiếp theo, các chất đường, dextrin cĩ phân tử thấp sẽ đượcchuyển hĩa thành rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác tạo thành bia theo yêu cầukỹ thuật và chất lượng sản phẩm.
1. Đường hĩa nguyên liệu:
a. Chuẩn bị nguyên liệu:
Malt là nguyên liệu chính cung cấp tinh bột và Amylase cho đường hĩa.
Malt: là tên gọi ngũ cốc nảy mầm ( Đại mạch, tiểu mạch, thĩc gạo, lúa mì đen, thĩcnếp…). Trong sản xuất bia, người ta dùng chủ yếu là đại mạch nảy mầm. Hạt đại mạch lànguồn cung cấp nguyên liệu cho đường hĩa , tạo đường cho sự lên men về sau .
Trong quá trình nảy mầm của hạt sẽ tích tụ được nhiều men mới, tăng hoạt tính hàng loạt men và Amylase tăng hoạt tính đáng kể, cần thiết cho quá trình đường hĩa.
Hoạt lực của α-Amylase cĩ thể ghi nhận được vào những thời điểm đầu tiên của quátrình ươm mầm, cịn đến ngày thứ ba hoặc ngày thứ tư thì hoạt lực của chúng sẽ tăng mộtcách đáng kể. Thời gian để α-Amylase đạt được hoạt lực cực đại phụ thuộc vào nhiệt độ ươmmầm. Ví dụ ở nhiệt độ 12 – 140C hoạt lực đạt cực đại sau 11 – 12 ngày đêm, nếu ở nhiệt độ18 – 200C hoạt lực đạt cực đại sau 6 – 7 ngày đêm. Cịn nếu nhiệt độ 25 – 280C thì chỉ cần sau4 ngày là Enzyme này đạt được hoạt độ tối đa.
Ngồi Amylase hoạt độ của protease, sitase, maltase, phosphatase cũng tăng lên.
Quá trình oxy hĩa – khử lượng men tạo thành tập trung phần lớn ở gần phơi và nộinhũ. Phần trên nội nhũ chứa 25% lượng men cĩ trong malt. Trong quá trình nảy mầm cĩ mộtsố quá trình sinh hĩa xảy ra như sau: Thủy phân một phần tinh bột ( 20 – 25% ) ra đường đơngiản hơn. Đường oligo - polysaccharide cĩ bị phân giải một phần thành monosaccharide vàtrisaccharide. Lipase thủy phân một phần lipid thành acid béo và glycerine
KIL OB OO KS .CO M
Do việc tạo thành acid hữu cơ và vơ cơ nên độ chua của hạt này mầm tăng cao , pH 5,6 – 5,9.
b. Đường hĩa:
Đường hĩa là cơng đoạn sản xuất bia rất quan trọng, trong đĩ lượng đường được tạothành sẽ quyết định khả năng lên men và chất lượng bia sau này. Chính vì thế, nhiều nhà máybia trên thế giới đã cho thêm Enzyme với số lượng lớn trong giai đoạn này. Các Enzyme vàotrong giai đoạn này là những Enzyme vi khuẩn chịu nhiệt.
Biến đổi sinh hĩa của quá trình đường hĩa là thủy phân tinh bột thành dextrin vàđường đơn giản (maltose, glucose…) dễ tan và lên men dưới tác dụng của Amylase trongmalt, ở nhiệt độ và pH tối ưu .
Cĩ quá trình thủy phân protid – peptid , peptone, acid amin hịa tan được trong dung dịch nhờ Enzyme protease, peptidase cĩ trong malt.
Cellulose, peptin cũng bị thủy phân, tạo thành sản phẩm hịa tan được trong dung dịch, tamin bị oxy hĩa tạo ra Flobafel tạo thêm màu cho bia
Malt xay nhỏ trộn với nước thành dịch hồ, nâng nhiệt độ lên 60 – 700Cgiữ trong 30đến 40 phút, sau đĩ nâng lên nhiệt độ 750C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi đường hĩa xong(PH 4,6 - 5,8 )
Hiện nay cĩ nhiều phương pháp đường hĩa, nâng nhiệt độ nhiều đợt 2 - 3 lần hoặc nâng nhiều đợt từng phần riêng rồi pha trộn lẫn nhau
Với nguyên liệu fi-malt giàu bột (ngũ cốc) trước khi đường hĩa và trộn malt cần xaynhỏ trộn nước nấu sơ bột thành hồ hoặc cháo lỗng, dung dịch đường hĩa gọi là dịch đườngmaltose, lọc xong ta cĩ nước “mout”. Nước “mout” được đun sơi với hoa houblon ( 18-26g/10 lít bia ở Việt Nam) .
Trong nước “mout”, sau khi đường hĩa cĩ chứa 90% là các chất Carbohydrate, trongsố này cĩ đến 75% đường cĩ khả năng lên men. Phần cịn lại 25% là các loại dextrin mạchthẳng và mạch nhánh. Trong nhiều trường hợp, lượng đường tạo thành khơng đạt được mứcđộ trên do nhiều nguyên nhân. Trong đĩ nguyên nhân chính là chất lượng malt kém. Cĩ bacách để làm tăng lượng đường trong nước “mout”:
+ Kéo dài thời gian đường hĩa + Sử dụng thêm đường
+ Sử dụng Enzyme để đường hĩa hết lượng tinh bột
Trước đây người ta thường áp dụng hai cách trên. Sau này, việc sử dụng
Enzyme thường được sử dụng hơn. Người ta thường sử dụng các loại chế phẩm Enzyme sau:
KIL OB OO KS .CO M
Các loại Enzyme thủy phân tinh bột sử dụng trong sản xuất bia (bảng t33)
Các loại Enzyme khi cho thêm vào trong sản xuất bia thường nhằm vào những mục đích sau:
+ Nâng cao chất lượng dịch đường hĩa + Nâng cao khả năng lên men bia
+ Nâng cao chất lượng và ổn định chất lượng bia.
+ Giảm giá thành sản phẩm khi tiến hành thay malt bằng những nguyên liệu phi malt.
Những ưu điểm của Enzyme từ nguồn VSV được sử dụng trong sản xuất bia như sau:
+ Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường cĩ hoạt tính xúc tác rất mạnh và chứa kháđầy đủ các loại Enzyme cần thiết cho sự chuyển hĩa tinh bột thành các loại đường, đặc biệt làtạo ra được loại đường cĩ khả năng lên men với số lượng lớn.
+ Các chế phẩm Enzyme từ VSV thường cĩ khả năng hoạt động ở nhiệt độ rất cao.
Điều này rất thuận lợi cho việc vận hành quá trình dịch hĩa và đường hĩa.
2. Lên men bia
Là giai đoạn quan trọng quyết định cho chất lượng bia và hiệu suất sản xuất. Cơ sở sinh hĩa ( Saccharomyces cerevisiae )
C6H12O6 C2H5OH + CO2
Quá trình tạo acid hữu cơ và tạo rượu cao tác dụng với nhau tạo ra ester ảnh hưởngđến mùi vị bia.Trong quá trình lên men PH giảm dần , lúc đầu dịch lên men 5,3 -5,6 sau lênmen chính cịn 4,2 – 4,4.
Quá trình sinh lý đặc trưng trong giai đoạn đầu thời kỳ lên men là sinh trưởng , tăng sinh khối.
II. Ứng dụng trong sản xuất bánh mì:
Các chế phẩm Enzyme tinh khiết đượ c dùng để tăng cường và điều chỉnh cơng nghệcủa nhiều loạ i sản phẩm trong đĩ cĩ sản xuất bánh mì. Nguồn Enzyme thường sử dụng làmalt. Tuy nhiên trong những năm gần đây, nguồn