5. Phạm vi nghiên cứu của đề tài
1.6.1. Phương pháp “ba dòng”
Phương pháp “ba dòng” là phương pháp sản xuất hạt lai sử dụng ba dòng vật liệu làm bố mẹ, bao gồm:
-Dòng bất dục đực di truyền tế bào chất (Cytoplasmic Male Sterile- CMS -Dòng “A”) dùng làm dòng mẹ.
-Dòng duy trì tính bất dục (Maintainer- Dòng “B”) là dòng cho phấn dòng CMS để con lai luôn luôn bảo toàn hay duy trì tính bất dục của dòng CMS.
-Dòng phục hồi tính hữu dục (Restorer-dòng R), là dòng cho phấn dòng CMS. Sau khi “dòng A” đã được duy trì bằng cách lai giữa “dòng A” và “dòng B” để có một lượng lớn hạt của “dòng A”, lượng hạt này dùng để sản xuất hạt lai F1 bằng cách cho lai giữa nó với “dòng R”, khi cây lai mọc ra từ lô hạt này có phấn bình thường và cho ưu thế lai cao về nhiều tính trạng mong muốn.
1.6.1.1. Dòng bất dục đực di truyền tế bào chất (CMS)
a. Đặc điểm hình thái và cơ chế di truyền của dòng bất dục tế bào chất:
Các kết quả nghiên cứu về dòng CMS đều có chung một kết luận là loại dòng có bao phấn lép, khi nở hoa bao phấn không mở, màu trắng sữa hoặc vàng nhạt bên trong chứa những hạt phấn thoái hoá, nếu nhuộm hạt phấn bằng dung dịch I-KI 1% và soi lên kính hiển vi thì thấy hạt phấn có màu vàng nâu của Iốt, nhăn nheo hoặc có hình tam giác, hình thoi hay hình cầu khuyết... trong khi đó nhuỵ (cơ quan sinh sản cái) vẫn phát triển bình thường và nếu được thụ phấn từ các giống lúa khác sẽ tạo thành hạt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Theo giáo sư Yuan L.P (1986) [ 88 ], một dòng CMS lý tưởng cần phải có một số đặc điểm sau:
-Phải bất dục hoàn toàn và ổn định qua các vụ hoặc trước những biến động của điền kiện thời tiết.
-Có phổ phục hồi rộng, khả năng kết hợp cao với nhiều giống lúa, có cấu trúc hoa và tập tính nở hoa tốt, thời gian mở vỏ trấu kéo dài, vòi nhuỵ vươn dài và vươn ra ngoài vỏ trấu, bông trổ thoát khỏi bẹ lá đòng để dễ dàng nhận phấn từ các cây lúa bình thường khác bên ngoài.
Shinjio và Omura (1966) [67] đã phát hiện ra dòng bất dục đực đầu tiên ở loài phụ lúa trồng Japonica gọi là “BT”, từ nguồn tế bào chất của giống Chisurahboro II. Sau đó một số dòng bất dục đực tế bào chất của loài phụ Japonica được phát hiện ở Mỹ từ một nguồn tế bào chất của giống Birco Indica. Năm 1973, một dòng bất dục đực di truyền tế bào chất được tìm thấy thuộc loài phụ Indica, trong đó điển hình là kiểu bất dục “WA”: Er-Jiu-Nan 1A, Zhenshan 97A, V41A được phát hiện ở Trung Tâm nghiên cứu lúa lai Hồ Nam, Giang Tây và Phúc Kiến (Yuan L.P, 1987) [89].
Nhiều công trình nghiên cứu khoa học cho đến nay đều đi đến kết luận là di truyền tế bào chất được thực hiện thông qua bộ gen tế bào chất, không trải qua quá trình phân chia giảm nhiễm nên tính trạng được kiểm tra bởi gen trong tế bào chất không tuân theo quy luật di truyền của Menden mà di truyền qua tế bào sinh sản cái, các tính trạng của dòng mẹ hay hiệu ứng của dòng mẹ được di truyền ổn định từ đời này qua đời khác, (Nguyễn Thị Trâm, 1995) [16], [17].
Hiện tượng bất dục đực do sự tương tác giữa gene trong nhân với tế bào chất bất dục là hệ thống đưọc khai thác và sử dụng rộng rãi nhất, sự bất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
dục đực trong hệ thống này là kết quả tương tác giữa gene bất dục (S) của tế bào chất với gene lặn trong nhân (rr).
Kiểu gene của dòng CMS là S-rr và kiểu gene của dòng B là N-rr; kiểu
gene của dòng R là N-RR hoặc S-RR. Theo Yuan.L.P (1985) [87], cơ chế di truyền bất dục tế bào chất và phục hồi hữu dục được giải thích như sau:
Sr x Nr Sr x NR
Dòng A(nhân dòng CMS) Hạt lai F1 (sản xuất hạt lai)
Sơ đồ a.1. Cơ chế di truyền của nhân dòng A và sản xuất hạt lai F1
b. Phân loại các nguồn bất dục đực tế bào chất
Các nhà khoa học Trung Quốc đã phân loại các dòng CMS trên cơ sở biểu hiện về mặt di truyền, hình hạt phấn bất dục và phản ứng của chúng với các dòng phục hồi và duy trì.
Kiểu phân loại dựa theo di truyền:
+Bất dục đực bào tử thể (Sporophytic): Các dòng CMS thuộc dạng này có hạt phấn bất dục đực được xác định bởi kiểu gene của cây lúa. Khi kiểu
gene của cây có cấu trúc di truyền nhân là dạng đồng hợp tử lặn S-rr thì các hạt phấn sinh ra đều bất dục. Nếu kiểu gene của cây là S-RR hoặc N-RR thì hạt phấn sinh ra đều hữu dục.
Dòng A Srr Dòng B Nrr Dòng A Srr Dòng R NRR Srr SRr
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đặc điểm của dòng CMS bào tử thể: tính bất dục phấn ổn định, ít chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường, phổ phục hồi hẹp, lóng sát cổ bông ngắn hơn bình thường hoặc ngắn hơn bẹ lá đòng, do vậy một phần bông khi trổ khó thoát ra khỏi bẹ lá đòng (Nguyễn Thị Trâm, 1995) [16], [17]
+Hệ thống bất dục đực giao tử thể (Gametophytic): kiểu bất dục này do sự tương tác của một cặp gen lặn trong nhân cùng với một vài gen ảnh hưởng phụ trong nhân (Hu và Li, 1985) [43], (Zhu và cộng sự, 1985) [97]. Độ bất dục hạt phấn quyết định do chính kiểu gene của hạt phấn mà không có liên quan tới kiểu gene của cây mẹ (Sporophytic). Ở cây F1 tỷ lệ phấn bất dục và hữu dục ngang nhau, tuy nhiên tỷ lệ đậu hạt vẫn bình thường và không có cây bất dục sinh ra ở F2, do các giao tử gây bất dục bị loại bỏ hoàn toàn trong quá trình thụ tinh.
-Phân loại bất dục dựa theo quan hệ giữa dòng phục hồi và dòng duy trì: Mối quan hệ giữa dòng phục hồi phấn và duy trì kiểu “Hồng Liên” ngược với kiểu “WA”. Một số giống lúa lùn chín sớm thuộc loài phụ Indica như Zhénhan 97, Long-zhi, Wen Xian Zao... là dòng duy trì cho dòng bất dục đực kiểu “WA”, lại có khả năng phục hồi phấn mạnh cho dòng bất dục đực kiểu “Hồng Liên”. Ngược lại một số dòng phục hồi kiểu “WA” như Peta, Taiying 1, Indonesia 6 lại duy trì được tốt cho dòng bất dục kiểu “Hồng Liên”,(Nguyễn Thị Trâm, 1995)[16].
+Bất dục đực dạng hoang dại (Wild Abortion “WA”): các dòng CMS của dạng này được tạo ra do lai khác loài giữa lúa dại bất dục và lúa trồng, tính bất dục được kiểm tra bởi sự liên kết giữa hai gene lặn trong nhân và tế bào chất gây ra bất dục đực (Gao, 1981; Hu và Li, 1985; Lei và cộng sự, 1984; Liang, 1980) [39], [43], [50], [51].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sự bất dục đực thuộc nhóm Sporophytic do kiểu gen của cây mẹ quyết định độ bất dục.
+Bất dục kiểu “Hồng Liên”: kiểu bất dục này do sự tương tác của một cặp gene lặn trong nhân cùng với một vài gene ảnh hưởng phụ trong nhân (Hu & Li, 1985) [43], (Zhu và cộng sự, 1985) [97]. Độ bất dục hạt phấn quyết định bởi chính kiểu gene của hạt phấn và không có liên quan tới kiểu gene của cây mẹ.
Kiểu bất dục “BT”: đặc trưng cho loài phụ Japonica gồm các dòng CMS của Dian1, Dian3, LiningA...Đây là dạng bất dục đực giao tử thể (Gametophyte). Hu và Li (1985) [43]; Shinjyo (1972) [66] nhận xét: tính bất dục kiểu “BT” được thể hiện do sự tương tác một cặp gene lặn trong nhân và gene trong tế bào chất điều khiển.
-Phân loại dòng CMS theo hình dạng hạt phấn:
+Kiểu bất dục điển hình, đặc trưng bởi hạt phấn có hình dạng méo mó, hình tam giác, hình thoi, cầu khuyết...khi nhuộm KI 1% không chuyển màu, sự thui chột của hạt phấn xảy ra sớm ở thời kỳ hạt phấn đơn nhân (uninuclete stage), tới đầu giai đoạn hai nhân (Binucleate stage); Xushuhua, (1980,1982) [84], [80]. Các dòng CMS kiểu “WA” thuộc dạng này.
+Bất dục phấn hình cầu: hạt phấn thoái hoá ở giai đoạn hai nhân, hình hạt phấn tròn và không đều nhau, không nhuộm màu hoặc nhuộm màu rất ít trong dung dịch KI 1%; Xu, (1982) [82]. Các dòng bất dục kiểu “Hồng Liên” thuộc nhóm này.
+Bất dục nhuộm màu: hạt phấn bị thoái hoá ở thời kỳ ba nhân. Hạt phấn có dạng hình cầu, nhuộm từng phần hoặc nhuộm nhẹ trong dung dịch KI 1%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Theo quan điểm của các nhà khoa học Trung Quốc (Yuang L.P, 1997 [86], nếu bố mẹ xa nhau về mặt di truyền thì hạt phấn bất dục ở giai đoạn một nhân. Nếu bố mẹ có quan hệ gần hơn thì sự thui chột hạt phấn thường xảy ra ở giai đoạn 2 hoặc 3 nhân.
c. Các phương pháp tạo dòng CMS
Bất dục tế bào chất là sự tương tác giữa gene bất dục trong tế bào chất với gene lặn trong nhân (Yuan.L.P,1985) [87]. Để làm phong phú thêm nguồn bất dục đực tế bào chất (CMS) có thể có nhiều phương pháp:
-Tạo dòng CMS mới bằng cách thay đổi nguồn nhân của dòng CMS ban đầu. Virmani S.S (1983) [76]; Gao M, 1981 [38] đã kết luận: để tạo ra dòng CMS mới, làm phong phú nguồn bất dục đực ở lúa mà vẫn giữ được tính ổn định trong điều kiện nhiệt đới có thể chuyển gene bất dục đực dạng “WA” vào những giống lúa có nhiều đặc tính quý bằng phương pháp lai lại nhiều lần.
Phương pháp cải tiến tính trạng dòng duy trì (dòng B) lai lại để tạo ra dòng CMS mong muốn, bằng phương pháp thay đổi cây bố để tạo dòng bất dục đực đồng tế bào chất trong quá trình lai lại, nếu thấy độ bất dục giảm thì cần phải dùng phương pháp “đổi bố” duy trì.
-Chọn tạo dòng CMS có tế bào chất mới và dòng duy trì mới:
+Lai xa: là một trong những biện pháp thông dụng để tạo ra các dòng CMS mới. Thông thường các dòng mẹ là lúa dại; lúa nửa dại hoặc lúa Indica nguyên thuỷ chín muộn lai với giống bố cải tiến như giống Japonica chín sớm, Indica chín sớm và chín trung bình; nếu thu được cây bất dục thì lai lại với dòng bố liên tục, ta sẽ chọn được dạng bất dục với nguồn tế bào chất mới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
và cây bố là dòng duy trì mới (Yuang.L.P và Xi-Qin-Fu,1985, [93]; Sampath và Mohanty (1954) [61]
Shinjyo và Omura (1966) [65] là những người tạo lên sự bất dục bằng lai xa giữa Indica và Japonica (Chinsurash BoroII/ Taichung 65: trong đó Taichung 65 là bố lai lại liên tục).
Bằng phương pháp lai lại, dòng CMS “Hồng Liên” rất phổ biến ở miền Nam Trung Quốc cũng đang được tạo ra do lai khác loài giữa lúa dại có râu đỏ với giống lúa trồng (Wuhan University, 1997) [81]
+Phương pháp gây đột biến (phóng xạ hay hoá học) cũng có thể làm xuất hiện dạng CMS mới.
Sarma (1987) [62] đã thành công trong việc tạo ra những cây bất dục bằng cách xử lý với Ethyl methane sunfonate (EMS) và sodium acide. Đột biến gây bất dục đực do đột biến gene lặn hoặc những biến đổi về gene có thể xảy ra trong AND .
1.6.1.2.Dòng duy trì bất dục (Maintainer-dòng”B”)
Dòng duy trì bất dục là dòng cho phấn dòng bất dục đực tế bào chất để bảo tồn được tính bất dục của dòng CMS. Tế bào chất của dòng duy trì không có gene bất dục và trong nhân chứa cặp gene lặn (rr). Kiểu gene của dòng duy trì là N(rr). Khi gieo trồng cây vẫn cho phấn bình thường nhưng không có khả năng phục hồi phấn cho dòng bất dục.
Nhiều nhà khoa học cho rằng để tìm được dòng duy trì cần phải sử dụng dòng bất dục đực tế bào chất làm mẹ lai với nhiều dòng có đặc tính mong muốn. Hạt lai thu được gieo thành hàng, khi trỗ kiểm tra hạt phấn, các tổ hợp nào có tỷ lệ hạt phấn bất dục cao trên 90% chọn để lai lại với bố. Tiếp tục gieo lại hạt lai, kiểm tra hạt phấn cây lai, tiến hành lai lại, kiểm tra và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chọn lọc đến khi nào dòng bất dục có tỷ lệ hạt phấn bất dục 100% thì dòng bố đó chính là dòng duy trì (Nguyễn Thị Trâm, 1995) [16].
Trần Duy Quý và cộng tác viên (1994) [24], [25] cho biết Việt Nam có đủ khả năng tạo ra các dạng bất dục đực trên cơ sở những bộ giống lúa đang gieo trồng hiện nay, trước mắt cần phải duy trì các cặp dòng bất dục Zhenshan 97A/B; BoA/B.
1.6.1.3. Dòng phục hồi phấn (Restorer)
Dòng phục hồi phấn là dòng cho phấn để sản xuất hạt lai F1, con lai F1 có ưu thế lai cao và hữu dục cao, nó có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chương trình chọn giống nhằm khai thác tính bất dục đực di truyền tế bào chất
a. Nguồn gốc phân bố của các gene phục hồi và sự di truyền của tính trạng phục hồi phấn.
Theo Lin và Yuan (1980) [89]; Shinjio (1975) [66]; Virmani và Edwards (1983) [76] cho biết gene phục hồi phấn ở lúa dễ tìm thấy ở những vùng trồng lúa nhiệt đới, không thể tìm thấy ở vùng ôn đới. Các dòng phục hồi hữu hiệu cho các nguồn tế bào chất bất dục dạng “WA”, “GAM” và “BT” được tìm thấy từ các giống lúa trồng và các dòng triển vọng khoảng 20% giống được tạo ra ở IRRI có khả năng phục hồi cho các dòng bất dục đực tế bào chất kiểu “WA” (Virmani và cộng tác, 1986), [77] (Li và Yuan, 1980), [52] hầu như không tìm thấy dòng phục hồi ở giống lúa Japonica.
Một số kết quả nghiên cứu khác cho thấy những giống lúa nguyên thuỷ có chứa một hoặc một số gene trội phục hồi phấn, các giống lúa có nguồn gốc ở vĩ độ thấp thuộc vùng Đông Nam á như IR24, Indonesia 6 và một số giống địa phương có khả năng phục hồi kiểu bất dục “WA”. Các giống lúa nguyên thuỷ chưa cải tiến hoặc các giống lúa bố mẹ là giống nguyên thuỷ, thường chứa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chu kỳ chiếu sáng ngắn, giống Indica trung ngày đều có khả năng phục hồi ở mức độ khác nhau. Các giống Indica chín sớm rất khó tìm được dòng phục hồi hoặc có thì khả năng phục hồi yếu, các giống thuộc loài phụ Japonica hầu như không tìm được gene phục hồi (Nguyễn Thị Trâm, 1995) [16].
Tìm hiểu về sự phân bố địa lý của các gene phục hồi với các dạng bất dục đực tế bào chất cho thấy, đối với dạng bất dục đực tế bào chất kiểu “BT” qua lai thử với 153 dòng giống lúa thu nhập từ 15 quốc gia, có 54 giống cho con lai F1 với tỷ lệ đậu hạt trên 70% là những giống phục hồi, 28 giống có khả năng phục hồi yếu và 71 giống hoàn toàn không có khả năng phục hồi. Đặc biệt trong 150 giống của Nhật Bản có 131 giống không có khả năng phục hồi và 19 giống phục hồi từng phần, những dòng phục hồi yếu này lại tập trung chủ yếu ở miền Nam Nhật Bản (Shinjio, 1972) [66]. Hầu hết các dòng phục hồi phấn cho CMS thuộc “BT” đều có gen phục hồi từ giống lúa Indica.
Shinjio (1975) đã kết luận, ở Châu á các giống phục hồi phấn chủ yếu tập trung phân bố ở Nam Trung Quốc, Nam và Đông Nam á [65,66], trong khi ở Châu Âu và bang California, nơi trồng lúa Japonica không tìm thấy
gene phục hồi phấn.
Tại Trung Quốc, nhiều dòng phục hồi phấn cho các dòng CMS dạng “WA” được tìm thấy ở vùng vĩ độ thấp (Đông Nam Châu á và miền Nam Trung Quốc). Trái lại ở nơi có vĩ độ cao như phía Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, các nước Đông Âu... hầu như không tìm thấy các giống phục hồi phấn cho các dòng bất dục đực tế bào chất dạng “WA” (Lizebing và Zhu, 1986) [ 54 ].
Liang và Cộng sự (1989) [51] cho rằng, các giống có gene phục hồi mạnh chủ yếu phân bố ở Nam và Đông Nam Châu á, Nam Trung Quốc. Các giống lúa của Nhật Bản, Triều Tiên, Châu Âu không tìm thấy giống có gene
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn