Tiến hành đánh giá mức độ thay đổi di truyền của các dòng cây tái sinh từ mô sẹo chịu lạnh với 10 mồi ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotit. Sản phẩm của phản ứng RAPD được điện di trên gel agarose. Kết quả phân tích sản phẩm điện di phản ứng RAPD của các dòng và giống gốc XCH với các mồi trên được trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Tổng số băng ADN được nhân bản của 6 mẫu lúa khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên
Mồi XCH D05 D26 D32 D36 D45 Tổng số băng ADN M2 5 8 6 6 8 5 38 M3 5 5 5 5 5 5 30 M4 5 9 7 8 8 7 44 M5 6 6 6 6 6 6 36 M7 6 8 5 5 7 7 38 M8 4 7 3 4 6 4 28 M10 5 8 6 8 6 5 38 M14 7 7 5 5 6 5 35 M15 3 3 3 3 3 3 18 M17 4 4 4 4 4 4 24 Tổng 50 65 50 54 59 51 329
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, với 10 mồi ngẫu nhiên, chúng tôi đã thu được 329 băng ADN. Trong tổng số 10 mồi phân tích, băng ADN được nhân bản của 6 mẫu lúa với mồi M4 là nhiều nhất (44 băng) và ít nhất là mồi M15 (18 băng). Tổng số băng ADN được nhân bản của các mẫu lúa dao động từ 50 - 65. Trong đó, dòng D05 nhân bản được nhiều băng ADN nhất (65 băng), tiếp đến là các dòng D36 (59 băng), D32 (54 băng), dòng D45 (51 băng) và thấp nhất là dòng D26 (50 băng).
Tính đa hình các băng ADN thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng khi so sánh giữa các dòng với nhau và với giống gốc trong cùng 1 mồi. Trong 10 mồi phân tích, chúng tôi nhận được 6/10 mồi có sự biểu hiện đa hình, đó là các mồi M2, M4, M7, M8, M10, M14. Kết quả phân tích tính đa hình được trình bày ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Phân tích đa hình về băng ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên của 6 mẫu lúa nghiên cứu
STT Mồi Băng ADN
được nhân bản Kích thước (kb) Băng ADN đa hình % Băng ADN đa hình 1 M2 9 0,55 - 2,6 5 55,56 2 M3 5 0,8 - 2,7 0 0 3 M4 9 0,4 - 2,25 4 44,44 4 M5 6 0,85 - 2,0 0 0 5 M7 11 0,6 - 2,0 7 63,64 6 M8 7 0,4 - 1,9 4 57,14 7 M10 8 0,55 - 2,1 3 37,5 8 M14 9 0,85 - 3,4 5 55,56 9 M15 3 0,6 - 1,5 0 0 10 M17 4 0,65 - 1,8 0 0 Tổng số 71 0,4 - 3,2 27 38,03
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy, tổng số băng ADN của 6 mẫu lúa khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên là 71 băng, số băng ADN đa hình là 27, chiếm 38,03 % và số băng ADN không đa hình là 44, chiếm 61,97 %. Số băng ADN được nhân bản ở mỗi mồi dao động từ 3 - 11. Kích thước ước tính của các băng ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên là từ 0,4 - 3,4 kb. Trong số 6 mồi cho tính đa hình, mồi M7 có tỷ lệ băng ADN đa hình cao nhất (7/11 băng chiếm 63,64 %), thấp nhất là mồi M10 (chỉ 3/8 băng chiếm tỷ lệ 37,5 %). Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây khi chọn dòng ở lúa.
Dưới đây là kết quả phân tích sản phẩm PCR - RAPD của 6 mồi M2, M4, M7, M8, M10 và M14 khi điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,5%.
* Mồi M2
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M2 được thể hiện ở bảng 3.15 và hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M2 M: Thang ADN chuẩn băng ADN mất đi so giống gốc băng ADN mới xuất
hiện so với giống gốc
0,75 kb 1,0 kb 3,0 kb 10 kb 6,0 kb 0,5 kb 0,25kb M XCH D05 D26 D32 D36 D45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Điện di sản phẩm phản ứng RAPD với mồi M2, chúng tôi thu được 9 băng ADN. Số băng ADN được nhân bản ngẫu nhiên của các dòng từ 5 - 8 và có kích thước dao động từ 0,55 - 2,6 kb. Dòng có nhiều băng ADN được nhân bản nhất là dòng D05 với 8 băng, dòng có ít băng ADN được nhân bản nhất là dòng D45 với 5 băng. Trong tổng số 9 băng ADN được nhân bản có 5 băng ADN biểu hiện tính đa hình. Dòng D45 có các băng ADN giống với giống gốc, còn lại 4 dòng có sai khác so với giống gốc. Dòng D05 mất đi 1 băng có kích thước 0,75 kb và xuất hiện 4 băng mới có kích thước lần lượt là 1,55 kb; 1,25 kb; 0,7 kb và 0,6 kb so với đối chứng. Dòng D36 xuất hiện thêm 2 băng điện di mới có kích thước là 1,55kb và 0,7kb. Hai dòng D26 và D32 đều chỉ xuất hiện thêm 1 băng ADN mới so với ĐC ở kích thước khoảng 1,55kb.
Kết quả phân tích trên cho thấy, các dòng lúa nghiên cứu của thế hệ R1 có sự sai khác trong ADN hệ gen và dòng D05 là dòng có sai nhiều nhất so với đối chứng.
* Mồi M4
Kết quả điện di sảm phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M4 được thể hiện ở bảng 3.15 và hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M4
M: Thang ADN chuẩn băng ADN mất đi so giống gốc băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
3,0 kb 0,75 kb 0,25kb 1,0 kb 10 kb 6,0 kb 0,5 kb XCH D05 D26 D32 D36 D45 M
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả ở hình 3.11 cho thấy, khi nhân bản ngẫu nhiên ADN của 6 mẫu lúa nghiên cứu với mồi M4 đã có 9 băng ADN được nhân bản. Các băng ADN có kích thước dao động từ 0,4 - 2,25kb. Dòng D05 và D32 xuất hiện nhiều băng ADN nhất với 9 băng. Dòng D36 xuất hiện 8 băng ADN. Hai dòng còn lại là D26 và D45 chỉ có 7 băng ADN được nhân bản. Trong tổng số 9 băng ADN được nhân bản, có 4 băng biểu hiện tính đa hình chiếm 44,44 %. Tất cả các dòng đều có sự sai khác so với ĐC. Cả 5 dòng đều xuất hiện thêm 2 băng ADN mới so với ĐC ở kích thước 1,5 kb và 1,75 kb. Dòng D36 và D05 xuất hiện thêm 1 băng có kích thước khoảng 1,2 kb. Riêng dòng D05 và dòng 32 còn xuất hiện thêm 1 băng mới có kích thước là 2,0 kb. Như vậy, với kết quả nhận được trên đây, một lần nữa khẳng định có sự sai khác về mặt di truyền của các dòng lúa thế hệ R1 so với giống gốc.
* Mồi M7
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M7 đuợc thể hiện ở bảng 3.15 và hình 3.12.
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M7
M: Thang ADN chuẩn băng ADN mất đi so giống gốc băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Hình 3.13 cho thấy, khi sử dụng mồi M7 để thực hiện phản ứng RAPD của 6 mẫu lúa, chúng tôi đã thu được 11 băng ADN có kích thước từ 0,6 - 2 kb. Trong 11 băng ADN được nhân bản có 7 băng biểu hiện tính đa hình, chiếm 63,64%. Tất cả các dòng lúa đều có sự sai khác so với ĐC do đều mất đi băng ADN có kích thước 1,55 kb. Dòng D05 xuất hiện nhiều băng ADN nhất với 8 băng được nhân bản.
M XCH D05 D26 D32 D36 D45 10 kb 6 Kb 3 kb 1 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trong 8 băng ADN được nhân bản trên, xuất hiện 4 băng mới so với ĐC với kích thước lần lượt là 1,4 kb; 1,1 kb; 0,75 kb và 0,6 kb. Dòng D36 có 6 băng ADN được nhân bản, xuất hiện thêm 2 băng có kích thước 1,8 kb và 0,6 kb. Dòng 45 cũng có 6 băng ADN được nhân bản nhưng chỉ xuất hiện thêm 1 băng ADN ở kích thước 1,35 kb so với ĐC. Hai dòng D26 và D32 đều có 4 băng ADN được nhân bản, trong đó có 1 băng mới xuất hiện có kích thước khoảng 1,1 kb nhưng mất đi 1 băng có kích thước 0,8 kb. Như vậy, đây là đoạn mồi thể hiện tính đa hình nhiều nhất trong tổng số 10 đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng RAPD.
* Mồi M8
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M8 đuợc thể hiện ở bảng 3.15 và hình 3.13.
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M8
M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so giống gốc Băng ADN mới xuất hiện so với giống gốc
Hình 3.13 cho thấy, khi nhân bản ngẫu nhiên ADN của 6 mẫu lúa với mồi M8 thu được 7 băng ADN có kích thước dao động từ 0,4 - 1,9 kb và có 4 băng ADN thể hiện tính đa hình chiếm 57,14 % tổng số băng ADN. Dòng D26 có số băng ADN được nhân bản ít nhất, trong đó có 1 băng bị mất đi so với ĐC có kích thước 0,8 kb. Dòng D32 và D45 đều xuất hiện 4 băng ADN và các băng giống với ĐC. Dòng D05 và D36 có số băng ADN được nhân bản nhiều nhất với 7 băng,
XCH D05 D26 D32 D36 D45 M 10 kb 6kb 3kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong đó có 3 băng ADN mới xuất hiện so với ĐC với kích thước lần lượt là 1,9 kb, 1,5 kb và 1,25 kb.
* Mồi 10
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M10 đuợc thể hiện ở bảng 3.15 và hình 3.14.
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M10 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so giống gốc Băng ADN mới xuất
hiện so với giống gốc
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi M10 ở hình 3.14 cho thấy, có 8 băng ADN được nhân bản có kích thước khoảng 0,55kb - 2,1 kb với 3/8 băng ADN đa hình chiếm 37,5%. Dòng D05 và D32 có nhiều băng ADN được nhân bản nhất so với ĐC (8 băng), dòng D26, D36 có 6 băng ADN được nhân bản. Dòng có ít băng ADN được nhân bản nhất là dòng D45 (5 băng). Trong 6 dòng lúa nuôi cấy mô có 4 dòng (D05, D26, D32, D36) xuất hiện 1 băng ADN có kích thước khoảng 0,75 kb so với ĐC. Riêng hai dòng D05 và D32 còn xuất hiện thêm băng ADN có kích thước vào khoảng 1,4kb và 0,55 kb. Dòng D45 có các băng ADN giống với ĐC. Như vậy, dòng D05 và D32 có sai khác về genome nhiều nhất so với ĐC trong 5 dòng nghiên cứu. * Mồi 14 M XCH D05 D26 D32 D36 D45 10 kb 6 kb 3 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M14 đuợc thể hiện ở bảng 3.15 và hình 3.15.
Điện di sản phẩm phản ứng RAPD với mồi M14 (hình 3.15), chúng tôi thu được tổng số 9 băng ADN có kích thước dao động từ 0,85 - 3,2 kb. Trong tổng số 9 băng ADN có tới 5 băng ADN biểu hiện tính đa hình chiếm 55,56 %. Dòng D05, D26, D32 và D36 đều có cùng băng ADN được nhân bản (7 băng). Dòng có ít băng ADN nhất là D45 (6 băng)
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu lúa với mồi M14 M: Thang ADN chuẩn Băng ADN mất đi so giống gốc Băng ADN mới xuất
hiện so với giống gốc
Tất cả các dòng đều có sự sai khác so với ĐC do đều xuất hiện 1 băng mới 1,8 kb và mất đi 2 băng có kích thước khoảng 1,7 kb và 0,85kb so với ĐC. Ba dòng D26, D32 và D36 còn xuất hiện thêm 1 băng mới có kích thước 1,9kb. Dòng D05 xuất hiện thêm 1 băng ADN mới có kích thước 1,0 kb. Như vậy, sự xuất hiện hay biến mất các băng ADN với mồi M14 một lần nữa đã chứng tỏ các dòng lúa
R1 đã có có sự thay đổi ở mức độ genome so với giống gốc.
Qua kết quả phân tích sản phẩm RAPD của 6 mồi ngẫu nhiên với 6 mẫu lúa nghiên cứu cho thấy, giữa 6 mẫu lúa đã có sự khác nhau về mặt di truyền.
Để thiết lập mối quan hệ tương đồng di truyền, chúng tôi tiến hành mã hoá số liệu các băng ADN thu được ra ký tự 1 và 0 theo qui ước 1= xuất hiện băng ADN, 0= không xuất hiện băng ADN. Kết quả thống kê các băng ADN của các mẫu lúa
10 kb 6 kb 3 kb 1,0 kb 0,75 kb 0,5 kb 0,25 kb M XCH D05 D26 D32 D36 D45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nghiên cứu khi tiến hành phản ứng RAPD với 6 mồi đa hình được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Thống kê các băng ADN được nhân bản trong phản ứng RAPD với 6 mồi ngẫu nhiên
Mồi Kb Dòng Mồi Kb Dòng Gốc 05 26 32 36 45 Gốc 05 26 32 36 45 M2 2,6 1 1 1 1 1 1 M4 2,0 0 1 0 1 0 0 1,8 1 1 1 1 1 1 1,75 0 1 1 1 1 1 1,55 0 1 1 1 1 0 1,5 0 1 1 1 1 1 1,25 0 1 0 0 0 0 1,2 0 1 0 0 1 0 1,1 1 1 1 1 1 1 1,0 1 1 1 1 1 1 0,8 1 1 1 1 1 1 0,75 1 1 1 1 1 1 0,75 1 0 1 1 1 1 0,6 1 1 1 1 1 1 0,7 0 1 0 0 1 0 0,5 1 1 1 1 1 1 0,6 0 1 0 0 0 0 0,4 1 1 1 1 1 1 M7 2,0 1 1 1 1 1 1 M10 2,1 1 1 1 1 1 1 1,8 0 0 0 0 1 1 1,4 0 1 0 1 0 0 1,55 1 0 0 0 0 0 1,3 1 1 1 1 1 1 1,4 0 1 0 0 0 0 1,1 1 1 1 1 1 1 1,35 0 0 0 0 0 1 0,8 1 1 1 1 1 1 1,25 1 1 1 1 1 1 0,75 0 1 1 1 1 0 1,1 0 1 1 1 0 0 0,65 1 1 1 1 1 1 1,0 1 1 1 1 1 1 0,55 0 1 0 1 0 0 0,8 1 1 0 0 1 0 M14 3,4 1 1 1 1 1 1 0,75 0 1 0 0 0 0 2,5 1 1 1 1 1 1 0,6 0 1 0 0 1 0 1,9 0 0 1 1 1 0 M8 1,9 0 1 0 0 1 0 1,8 0 1 1 1 1 1 1,5 0 1 0 0 1 0 1,7 1 0 1 1 1 0 1,25 0 1 0 0 0 0 1,5 1 0 1 1 1 1 1,1 1 1 1 1 1 1 1,25 1 1 1 1 1 1 0,8 1 1 0 1 1 1 1,0 0 1 0 0 0 0 0,55 1 1 1 1 1 1 0,85 1 1 1 1 1 1 0,4 1 1 1 1 1 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Với tổng số 221 băng ADN thu được của cả 6 mẫu lúa nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xử lý số liệu trên phần mềm NTSYS 2.0 để thiết lập mối quan hệ di truyền và sơ đồ hình cây.