Hợp chất MX10 (50mg) là chất rắn hình kim màu vàng, Rf = 0,55(C:M tỉ lệ 8:2) có đặc điểm phổ:
Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT-NMR (125MHz, DMSO, δppm) (phụ lục 5,6,7,8) cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của 29 cacbon: 1 cacbon loại – CH3,2 cacbon loại –OCH3, 1 cacbon loại –CH2, 7 cacbon loại , 5 cacbon loại =CH-, 2 cacbon loại =C< , 2 tín hiệu cacbon với δC 101,17 ppm và δC 100,59 ppm đặc trưng cho 2 C-anomer của đường, 1 cacbon với δC 177,5 ppm đặc trưng cho nhóm >C=O, 8 cacbon của đường dạng >CH-O- xuất hiện trong vùng 76,41- 68,24 ppm, chi tiết độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử cacbon được trình bày trong bảng 6.
Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO, δppm) (phụ lục 2,3) : 7,54 (1H; d;
4J=2,5Hz); 7,04 (1H; d; 3J=8,5Hz); 7,73 (1H; dd; 3J=8,5Hz; 4J=2,5Hz); 6,68 (1H; d;
4J=2,0Hz); 6,37 (1H; d; 4J=2,0Hz); 1tín hiệu mũi đơn của proton –OH tại δH
12,53ppm; 1 tín hiệu mũi đôi tại δH 5,39ppm (1H; d; J=7,5Hz) và 1 tín hiệu mũi đơn tại δH 4,39ppm đặc trưng cho 2 H-anomer của đường. Chi tiết độ dịch chuyển hóa học của tất cả các proton được trình bày chi tiết trong bảng 6.
Phổ COSY, HSQC, HMBC (phụ lục 9-21) Biện luận cấu trúc hóa học:
Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT-NMR của hợp chất MX10 cho thấy có 29 cacbon, trong đó có 7 cacbon loại với δC [156,7; 133,8; 160,9;
165,2; 156,4; 145,9; 150,2]; 5 cacbon loại =CH- với δC [97,9; 92,3; 115,8; 111,4;
121,6]. Điều này phù hợp với phổ 1H-NMR xuất hiện 5 tín hiệu proton của vòng thơm: 7,54 (1H; d; 4J=2,5Hz); 7,04 (1H; d; 3J=8,5Hz); 7,73 (1H; dd; 3J=8,5Hz;
4J=2,5Hz); 6,68 (1H; d; 4J=2,0Hz); 6,37 (1H; d; 4J=2,0Hz). Ngoài ra, trên phổ 13C- NMR còn xuất hiện 1 cacbon với δC 177,5 ppm đặc trưng cho nhóm >C=O. Từ những dữ kiện của phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT-NMR và phổ 1H-NMR, chúng tôi dự đoán hợp chất MX10 có khung flavone.
C O
C O
O
O
A
B
3
2 5'
1
6' 1'
2' 3'
4' 8
7 6
5
10 4
9
Flavone
Phổ 1H-NMR (phụ lục 2,3) của hợp chất MX10 có xuất hiện tín hiệu của proton trong vùng 4-3ppm; 1 tín hiệu của 3 proton nhóm –CH3 [δH 0,98 ppm (3H;
d; J=6Hz)]; 2 tín hiệu H-anomer [δH 5,39 ppm (d, J=6Hz) và 4,39 (s)]. Đồng thời trên phổ 13C-NMR (phụ lục 5,6) kết hợp kĩ thuật DEPT-NMR (phụ lục 7,8) xuất hiện 2 C-anomer (δC 101,17 ppm và 100,78 ppm); 1 tín hiệu của cacbon –CH3 (δC
17,71 ppm), và tín hiệu của 8 cacbon liền kề trong vùng 76,41-68,24 và 1 cacbon của –CH2- (δC 66,87 ppm). Từ những dữ kiện trên, chúng tôi dự đoán hợp chất MX10 có 2 phân tử đường: 1 phân tử đường β-D-glucose ứng với H-anomer [δH
5,39 ppm (d; J=6Hz)] và một phân tử đường α-L-rhamnose ứng với H-anomer [δH
4,39 ppm (s)].
Kết hợp tất cả các dữ kiện, chúng tôi dự đoán hợp chất MX10 gồm 1 khung Hình 4: Một phần phổ 1H-NMR của hợp chất MX10
Cấu trúc của phần aglycol:
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu dạng singlet có độ dịch chuyển hóa học δH 3,86 ppm với cường độ tương đối 6H, đặc trưng cho proton của 2 nhóm – OCH3. Cacbon với δC177,5 ppm được quy kết cho C-4.
Vòng A được dự đoán là 1 vòng benzen có 4 nhóm thế vì chỉ còn 2 tín hiệu proton tại δH 6,68 ppm (1H; d; 4J=2,0Hz) và δH 6,37 ppm (1H; d; 4J=2,0Hz) (2 proton này ở vị trí meta với nhau vì có hằng số ghép nhỏ, J=2Hz).
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu proton tại δH 12,53 ppm chứng tỏ đây là nhóm –OH gắn ở vị trí C-5 của vòng A (vì H của nhóm –OH này tạo liên kết hydro nội phân tử với nhóm >C=O nên dịch chuyển về vùng trường yếu). Từ đó, chúng tôi cũng suy ra nhóm thế còn lại phải ở vị trí C-7.
Trên phổ HMBC, 2 tín hiệu proton của vòng A (δH 6,37 ppm và δH 6,68 ppm) cùng tương tác với tín hiệu cacbon loại tại δC 165,2 ppm và 105,0 ppm nên 2 cacbon này lần lượt được quy hết cho C-7 và C-10 [vì C-7 gắn trực tiếp với nhóm thế (nhóm –OH hoặc nhóm –OCH3)]. Đồng thời, tín hiệu proton tại δH 6,37 ppm là của H-6 và δH 6,68 ppm là của H-8 [vì H-6 có 2 nhóm đẩy điện tử (2 nhóm –OH hoặc 1 nhóm –OH và 1 nhóm –OCH3) ở vị trí ortho nên proton gắn trên C-6 sẽ cộng hưởng ở trường mạnh hơn so với proton gắn trên C-8]. Kết hợp phổ HSQC, chúng tôi quy kết được tín hiệu của C-6 là δC 97,9 ppm và C-8 là δC 92,3 ppm.
C O
Hình 5.1: Một phần phổ HMBC của hợp chất MX10
Trong phổ HMBC:
♦ H-6 tương tác với cacbon loại tại δC 160,9 ppm nên cacbon này được quy kết cho cho C-5.
♦ H-8 tương tác với cacbon loại tại δC 156,4 ppm nên cacbon này được quy kết cho C-9.
♦ Proton của nhóm –OCH3 (δH3,86 ppm) tương tác với cacbon tại δC 165,2 ppm (C-7). Điều này cho thấy nhóm –OCH3 được gắn vào vị trí số 7.
7
6 5
10 9 8
4 3
2
O
OH O H
H3CO
H
Hình 6: Tương quan phổ HMBC trên vòng A của MX10
Vòng B là 1 benzen mang 3 nhóm thế ở vị trí 1’, 3’, và 4’ với các tín hiệu proton tại δH 7,54 ppm (1H; d; 4J=2,5Hz); 7,73 ppm (1H; dd; 3J=8,5Hz; 4J=2,5Hz);
7,04 ppm (1H; d; 3J=8,5Hz), nên chúng tôi dự đoán vòng B mang 2 nhóm thế (-OH hoặc –OCH3) tại vị trí 3’ và 4’.
Trên phổ HMBC, proton tại δH 7,54 ppm (1H; d; 4J=2,5Hz) tương tác với 3 cacbon dạng tại δC 150,2 ppm; 145,9 ppm; 156,7 ppm. Từ đó, có thể dự đoán proton tại δH 7,54 ppm là H-2’.
Các tín hiệu còn lại tiếp tục được quy kết như sau:
H-2’ ghép meta với H-6’ có độ dịch chuyển là δH 7,73 ppm (1H; dd, J=8,5, J=2,5) nên tín hiệu proton tại δH 7,73 ppm là của H-6’ và do đó tín hiệu proton tại δH 7,04 ppm (1H; d, J=8,5) là tín hiệu của H-5’. Kết hợp phổ HSQC, có thể quy kết cacbon tại δC 115,8 ppm là của C-2’; 121,6 ppm là của C-6’; 111,4 là của C-5’.
Trong phổ HMBC, 3 proton H-2’, H-5’, H-6’ cùng tương tác với cacbon tại δC 150,2 ppm nên đây là tín hiệu của C-4’.
H-2’ và H-6’ cùng tương tác với cacbon có δC 156,7 ppm nên đây là C-2 C O
C O
C O
H-2’ và H-5’ cùng tương tác với cacbon tại δC 145,9 ppm nên đây là C- 3’.
H-5’ tương quan với cacbon dạng =C< tại δC 122,4 ppm nên đây là C-1’.
Như vậy, trong 15 tín hiệu cacbon của khung flavone trên phổ 13C-NMR chỉ còn tín hiệu cacbon dạng =C< với δC 133,8 ppm nên cacbon này phải là C-3.
Ngoài ra, proton của nhóm –OCH3 (δH 3,68 ppm) tương tác với cacbon tại δC 150,2 ppm (C-4’). Điều này cho thấy nhóm –OCH3 được gắn vào vị trí C-4’.
7
6 5
10 9 8
4 3
2
O
OH O H
H3CO
H
1'
2' 4' 5' 6'
H
H
H OCH3 H
3'
Hình 7: Tương quan phổ HMBC trên vòng B của hợp chất MX10 Hình 5.2: Một phần phổ HMBC của hợp chất MX10
Từ đó kết luận phần aglycol là 7,4’-Di-O-methylquercetin.
Biện luận đường
Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT xác định tín hiệu cacbon metyl – CH3 tại δC 17,17 ppm là C-6’’. Phổ HSQC xuất hiện tín hiệu tương quan H-anomer δH 4,39 ppm và cacbon tại δC 100,78 ppm nên đây là đường α-rhamnopyranose.
Phổ HMBC kết hợp với phổ HSQC và COSY có thể quy kết các tín hiệu còn lại của đường α-rhamnopyranose như sau: C-2’’ (δC 70,4 ppm), C-3’’ (δC 70,6 ppm), C-4’’
(δC 71,8 ppm), C-5’’ (δC 68,2 ppm).
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của nhóm –CH2-O- tại 66,89 nên có thể dự đoán đây là đường glucose. Phổ HSQC có tương tác giữa δH 5,39 ppm và δC 101,17 ppm nên đây là C-1’’.
Dựa vào phổ COSY, HMBC, HSQC chúng tôi quy kết các tín hiệu còn lại của đường D-glucose như sau C-2’’ (δC 74,1 ppm), C-3’’ ( δC 76,4 ppm), C-4’’ (δC
69,9 ppm), C-5’’ (δC 75,9 ppmm).
Ngoài ra, trên phổ HMBC còn xuất hiện tương tác giữa H-1’’’ (δH 4,39 ppm) với C-6’’ (δC 66,89 ppm) và tương tác giữa H-6’’ (δH 3,7 ppm) với C-1’’’ (δC 100,8 ppm) nên có thể khẳng định đường rhamnose gắn vào vị trí C-6’’ của đường glucose.
Trên phổ HMBC không có tín hiệu của H-anomer (H-1’’) của đường glucose tương tác với cacbon nào nhưng dựa vào cấu trúc của phần aglycol, chúng tôi dự đoán H-1’’ gắn vào vị trí C-3 hoặc C-3’ của phần aglycol. Nên hợp chất MX10 có thể là 7,4’-Di-O-methylquercetin-3-O-β-rutinoside hoặc là 7,4’-Di-O- methylquercetin-3’-O-β-rutinoside.
Kết hợp so sánh số liệu phổ của hợp chất MX10 với hợp chất 7,4’-Di-O- methylquercetin-3-O-β-rutinoside[16]chúng tôi thấy có sự trùng khớp tốt (kết quả so sánh được trình bày trong bảng 6). Từ đó, chúng tôi kết luận hợp chất MX10 là 7,4’-Di-O-methylquercetin-3-O-β-rutinoside hay còn gọi là Ombuin-3-rutinoside.
H3CO O
OH O
OCH3
OH
O 2 4 3 6
8
9 1'
2' 3' 4' 5' 6'
7
5 10
O
O
O
OH CH3 OH
OH 1''' 2''' 3'''
4''' 5'''
OH OH HO 2''
1''
3''
5'' 4'' 6''
6'''
Ombuin-3-rutinoside
Bảng 6: số liệu phổ NMR của hợp chất MX10 và hợp chất so sánh
Vị trí C
Ombuin-3- rutinoside (DMSO)
Hợp chất MX11 (DMSO)
HSQC HMBC
DEPT δC ppm δC ppm δH ppm (J=Hz) ( 1H 13C)
2 156,26 156,7
3 135,71 133,8
4 >C=O 177,39 177,5
5 160,76 160,9
6 =CH- 97,74 97,9 6,37(d; 2,0) 5; 7; 8; 10
7 165,00 165,2
C O C O
C O
C O
8 =CH- 92,10 92,3 6,68 (d; 2,0) 6; 7; 9; 10
9 156,51 156,4
10 =C< 104,88 105,0
1’ =C< 122,74 122,4
2’ =CH- 115,70 115,8 7,54 (d; 2,5) 2, 3’; 4’; 6’
3’ 145,74 145,9
4’ 150,01 150,2
5’ =CH- 111,28 111,4 7,04 (d; 8,5) 1’; 3’; 4’
6’ =CH- 121,34 121,6 7,73 (dd; 8,5; 2,5) 2; 2’; 4’
1’’ >CH-O- 101,07 101,17 5,39 (d; 7,5)
2’’ >CH-O- 73,93 74,1 3,25 (m) 3’’
3’’ >CH-O- 76,32 76,4 3,29 (m) 2’’; 5’’
4’’ >CH-O- 69,77 69,9 3,12 (m) 5’’
5’’ >CH-O- 75,74 75,9 3,26 (m) 6’’ -CH2-O- 66,74 66,9 3,7 (d; 10)
3,33 (m)
1’’’
1’’’ >CH-O 100,59 100,8 4,39 (s) 6’’; 2’’’; 3’’’;
5’’’
2’’’ >CH-O 70,21 70,4 3,12 (m)
3’’’ >CH-O 70,49 70,6 3,42 (m) 2’’’; 4’’’
4’’’ >CH-O 71,72 71,8 3,08 (m)
5’’’ >CH-O 68,04 68,2 3,28 (m) 2’’’; 3’’’
6’’’ -CH3 17,49 17,71 0,98 (d; 6) 4’’’; 5’’’
7 -OCH3 55,51 55,7 3,86 (s)
4’ -OCH3 55,87 56,1 3,86 (s)
5- OH
12,5 (s) C O
C O C O