2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BI ̣ 2.1.1. Nguyên liệu
- Mẫu nghiên cứu: Lá cây Gạo, sấy ở 60oC đến khô, nghiền thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu.
- Nơi thu hái: Hương Sơn, Mỹ Đức, Hà Nội.
- Mẫu cây Gạo đã đƣợc TS. Trần Huy Thái - Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học là Bombax malabaricum DC., họ Gạo (Bombacaeae).
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn của Dƣợc điển Việt Nam IV [5].
2.1.2.2. Máy móc thiết bị
- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck).
- Bột silicagel cỡ hạt 40 - 63àm.
- Cột sắc ký
- Cân kỹ thuật Sartorius - Cân phân tích Precisa - Đèn tử ngoại
- Máy xác định độ ẩm Sartorius - Nồi cách thuỷ
- Tủ sấy Shellab
- Kính hiển vi Leica CME
15
- Máy ảnh Canon IXY
- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200
- Máy đo phổ khối lƣợng (ESI-MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hotstage, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Định tính các thành phần hoá học
Định tính các nhóm chất trong mẫu nghiên cứu bằng SKLM [2], [3], [6], [13].
- Dịch chấm sắc ký: Mẫu phân tích hòa tan trong methanol.
- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn đƣợc hoạt hóa 1h ở 1100C. Để nguội.
- Khai triển vớ i nhiều hê ̣ dung môi khác nhau .
- Hiện màu vớ i thuốc thử H2SO4 10% trong cồn 96%, quan sát dưới ánh sáng thường.
- Tiến hành: Chấm dịch chiết lên trên bản mỏng, sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hết dung môi. Phát hiện vết ở AST, soi dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm. Sau đó phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol 96% lên bản mỏng, sấy khô ở nhiệt độ 1100C rồi quan sát dưới AST.
2.2.2. Chiết xuất
- Xác định độ ẩm của bột dược liệu
16
Lá Gạo sau khi sấy khô nghiền thành bột thô. Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cƣ́u đ ể xác định độ ẩm của dƣợc liệu. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110oC, rắc bột dƣợc liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình. Đọc kết quả.
- Chiết xuất
Chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh với methanol ở nhiệt độ phòng. Sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, cloroform và ethyl acetat. Thu đƣợc 3 phân đoạn dịch chiết và phần dịch chiết nước. Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn. Các cắn đƣợc làm khô đến khối lƣợng không đổi.
Cân cắn.
- Tính hiệu suất chiết
Hàm lượng % của các cắn so với khối lượng bột dươ ̣c liê ̣u đư ợc tính theo công thức sau:
Xi% =
) 1 (
% 100 .
x M
a
trong đó: Xi: Hàm lƣợng cắn i (%)
M: khối lƣợng dƣợc liệu đem chiết (g) x: độ ẩm dƣợc liệu (%)
a: khối lƣợng cắn i (g) 2.2.3. Phân lập
Sử dụng phương pháp sắc ký cột thông dụng để phân lập các chất . - Cột sắc ký:
- Chất hấp phụ: Silicagel cú kích thước h ạt 40-63àm (230-400 mesh).
- Tiến hành:
+ Chuẩn bi ̣ cột: cột rƣ̉a sa ̣ch, sấy khô, lắp thẳng đƣ́ng trên mô ̣t giá cố đi ̣nh . + Ổn định cột:
17
Lót một lớp bông ở đáy cột. Cân một lươ ̣ng silicagel cần dùng vào c ốc có mỏ. Thêm dung môi rƣ̉ a giải vào , khuấy đều.
Mở vòi, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để silicagel lắng tự nhiên xuống đáy cột. Hứng dung môi và rót liên tục lên cột trong một thời gian. Chú ý không để khô dung môi ở cột. Ổn định cột trong 12 giờ.
+ Đưa mẫu vào cột:
Trô ̣n đều mô ̣t lươ ̣ng bô ̣t silicagel với dung di ̣ch cắn , để dung môi bay hơi hết, làm thành bột mịn, rải thành một lớp đều đặn trên mă ̣t silicagel.
+ Rử a giải:
Sƣ̉ dụng hê ̣ dung môi thích hợp đ ể rửa giải. Kiểm soát tốc đô ̣ dòng chảy. Hƣ́ng di ̣ch rƣ̉a giải vào bình nón , ống nghiệm với thể tích thích hợp . Sử dụng SKLM để kiểm tra thành phần dịch hứng, dồn các phân đoạn có cùng thành phần.
- Tinh chế các chất thu được
- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập
Độ tinh khiết của chất phân lập đƣợc kiểm tra bằng SKLM . Mỗi chất phân lâ ̣p đươ ̣c kiểm tra bằng nhiều hê ̣ dung môi khác nhau .
2.2.4. Nhận dạng chất tinh khiết
Nhận dạng chất phân lập đƣợc dựa trên dữ liệu phổ MS, 1D- và 2D- NMR.
18
Chương 3