CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
2.4. Kỹ thuật thực nghiệm
2.4.1. Chuẩn bị hóa chất phân tích
Axit kaurenoic (1027 mg) tiêu chuẩn (độ tinh khiết 90%) đƣợc phân lập từ lá na Annona muricata.
- Pha dung dịch ACN : H2O= 85:15 (v/v) trong bình định mức 100 ml.
- Cân 10 mg chất chuẩn cho vào bình định mức 10 ml ; định mức đến vạch bằng dung dịch pha động ta đƣợc chuẩn gốc 1000 ppm.
- Đánh siêu âm để chất chuẩn hòa tan hoàn toàn vào dung môi sau đó lọc qua màng lọc rồi pha loãng ta đƣợc các dung dịch chuẩn trung gian.
Pha dãy chuẩn : pha loãng nồng độ 25ml, 50 ml, 100 ml và 500ml bằng hỗn hợp dung dịch pha động.
Lấy 5ml dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng dung dịch ACN : H2O= 85:15 (v/v) ta đƣợc chuẩn 500 ppm.
Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng dung dịch ACN : H2O= 85:15 (v/v) ta đƣợc chuẩn 100 ppm.
Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc 500 ppm cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng dung dịch ACN : H2O= 85:15 (v/v) ta đƣợc chuẩn 50 ppm.
Lấy 5 ml dung dịch chuẩn trung gian 50 ppm vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng dung dịch ACN : H2O= 85:15 (v/v) ta đƣợc chuẩn 25 ppm.
Dung dịch chuẩn gốc sau khi pha loãng tiêu chuẩn, có thể lưu giữ tại 4°C trong vòng một tuần.
2.4.2. Xây dựng đường chuẩn
Để xác định được hàm lượng của axit kaurenoic trong mẫu người ta dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích peak trên đường chuẩn đã được thiết lập sẵn. Dựa vào đường chuẩn và diện tích peak đo được ta sẽ tính đƣợc hàm lƣợng Axit kaurenoic.
Chuẩn bị: Để xây dựng đường chuẩn ta chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn đã biết chính xác nồng độ. Cụ thể ở đây chúng tôi chuẩn bị 4 mẫu có nồng độ lần lƣợt là: 25ppm; 50ppm; 100ppm; 500ppm. Bơm vào máy HPLC đã được cài đăt chương trình.
2.4.3. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu
Để xác định hàm lƣợng axit kaurenoic trong mẫu thuộc chi Annona cần phải xử lý mẫu và bơm vào máy HPLC.
- Nguyên tắc xử lý mẫu:
Tách chất phân tích axit kaurenoic khỏi các tạp chất vào dung môi pha động. Lọc qua giấy lọc và lọc qua màng lọc 13mm, 0,45μm.
- Cách tiến hành:
Cân các mẫu đã đƣợc xay nhỏ (khoảng 2g; với độ ẩm 24%).
Mẫu 1 (ký hiệu mẫu na 001) : 2,0004 g Mẫu 2 (ký hiệu mẫu na 002) : 2,0001 g Mẫu 3 (ký hiệu mẫu na 003) : 2,0006 g Mẫu 4 (ký hiệu mẫu na 004) : 2,0003 g Mẫu 5 (ký hiệu mẫu na 005) : 2,0006 g Mẫu 6 (ký hiệu mẫu na 006) : 2,0002 g
Hòa tan mẫu với 20 ml dung dịch ACN : H2O= 85:15 (v/v).
Lắc đều, siêu âm trong 30 phút.
Ly tâm mẫu đã siêu âm xong trong 10 phút,tốc độ 3500 vòng/phút.
Mẫu sau ly tâm đƣợc lọc qua giấy lọc,sau đó lọc qua màng lọc rồi cho vào các vial khác nhau.ghi nhãn cho từng mẫu ở từng vial rồi đƣa đi phân tích HPLC.
Các mẫu được lưu trữ (4 ° C trong bóng tối) cho đến khi phân tích HPLC.
Quá trình chuẩn bị mẫu theo sơ đồ sau:
Hình 2.6: Sơ đồ chuẩn bị mẩu Na
2.4.4. Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV
- Cột sắc ký : Cột pha đảo RP 18 (150 x 4,6 mm, 5 μm) - Nhiệt độ cột : Nhiệt độ phòng
- Pha động : ACN : H2O(85 : 15 v/v ).
Đánh siêu âm đến hết bọt trước khi sử dụng - Thể tích tiêm mẫu : 20μl.
- Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút
- Bước sóng đầu dò UV đo ở 210 nm.
- Áp suất 68-71 bar.
- Thời gian lưu là 17,3 ± 0,2 min.
2.4.5. Tối ưu hóa phương pháp Mẫu Na Nghiền nhỏ
Siêu âm (30 phút)
Ly tâm (10 phút) Lọc (giấy lọc) Lọc (màng lọc)
Vial HPLC
ACN: H2O
Quá trình tối ưu hóa được thực hiện nhằm mục đích chọn ra phương pháp có tỉ lệ thất thoát hàm lƣợng axit kaurenoic trong mẫu là ít nhất, cho hiệu suất cao nhất, kết quả chính xác nhất, cho ra peak đẹp nhất khi phân tích HPLC.
Phương pháp HPLC axit kaurenoic đã được tối ưu hóa có tính đến các tổn thất trong các bước chiết với các dung môi khác nhau.
Chạy khảo sát chọn các điều kiện : - Thể tích bơm mẫu : 20 μl
- Nhiệt độ cột RP 18 : 300C
- Detector UV (VWD) : λ = 210 nm - Tốc độ dòng : 1,0 ml/min
- Áp suất cột: 71 Bar
- Pha động ACN : H2O (80 : 20 v/v )
Kết quả cho ra peak ở 10,091 min.Peak choãi chân, không nhọn, không cân đối.
+) Thay đổi 1 số điều kiện :
- Pha động ACN : H2O (85 : 15 v/v ) - Nhiệt độ cột: 400C
Kết quả không có peak.
+) Thay pha động ACN : H2O (75 : 25 v/v ) - Nhiệt độ cột: 300C
- Kết quả cho peak nhỏ, không rõ.
+) Thay pha động ACN : H2O (85 : 15 v/v ) - Nhiệt độ cột: 300C
Kết quả cho peak ở thời gian lưu 10.039 min.
Peak đẹp, choãi chân, nhọn, cân đối.
Do đó chọn các điều kiện chạy máy là :
- Dung dịch pha động ACN : H2O(85 : 15 v/v ) - Thể tích bơm mẫu :20 μl
- Nhiệt độ cột RP 18 : 300C
- Detector UV (VWD) : λ = 210 nm - Tốc độ dòng : 1,0 ml/min
- Áp suất cột: 71 Bar.