Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1.1. Phương pháp thu thập mẫu máu trâu
- Chúng tôi thu thập mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, phân tầng theo các lứa tuổi của trâu tại huyện Yên Sơn – tỉnh Tuyên Quang.
- Dung lượng mẫu được tính toán theo công thức của tổ chức WHO (1991):
n = (Z1 - α/2)2 x p (1 - p) d2
Trong đó: n là số mẫu tối thiểu cần đạt được P là tỷ lệ gia súc nhiễm bệnh dự kiến (1- p) là tỷ lệ gia súc không nhiễm bệnh
d là độ chính xác mong muốn (< 0,05 hay hệ số tin cậy 95%) (Z1 - α/2)2 có giá trị 1,96
3.4.1.2. Phương pháp lấy mẫu máu
- Sát trùng vùng tĩnh mạch cổ trâu bằng cồn 700. Dùng xilanh nhựa 3 ml lấy máu tĩnh mạch cổ trâu. Mỗi trâu không lấy quá 1 ml máu, tiêm ngay 0,2 ml máu vào phúc mạc cho chuột bạch, sau đó dùng phiết kính 3 tiêu bản máu. Ghi ký hiệu mẫu; thể trạng trâu; triệu chứng lâm sàng (nếu có);
tên chủ hộ; địa chỉ; ngày lấy mẫu. Bảo quản ở 40C.
3.4.2. Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trong mẫu 3.4.2.1. Phương pháp xem tươi (Direct smear)
T. evansi là loại ký sinh trùng sống ở máu và trong tổ chức; trong trường hợp mật độ ký sinh trùng trong máu thấp, TMT sống ở trong các vi mạch nhỏ; vì vậy, nên lấy máu để chẩn đoán ở vùng ngoại vi.
Cho 1 giọt máu tươi lên phiến kính đã có sẵn 1 giọt dung dịch EDTA 1%; dùng góc lamen lên dàn máu thành một lớp mỏng; sau đó soi dưới kính hiển vi (10x20 hoặc 10x40) để phát hiện T. evansi qua sự di chuyển của hồng cầu.
Kết quả:
Dương tính: Khi thấy tiên mao trùng di động, bơi trong huyết tương.
Âm tính: Chỉ nhìn thấy hồng cầu.
3.4.2.2. Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky) Đặt một giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng lamen ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2 phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (pha dung dịch Giemsa mẹ với nước cất theo tỉ lệ 1:9).
Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100) quan sát tìm T. evansi.
Kết quả: Dương tính khi tìm thấy tiên mao trùng bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất bắt màu tím hoặc xanh thẫm. Tiên mao trùng có một nhân chính và một nhân phụ, roi... Hồng cầu bắt màu hồng đều, bạch cầu nhân bắt màu sẫm.
3.4.2.3. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm
Dùng máu của trâu cần chẩn đoán tiêm trực tiếp cho chuột bạch (không sử dụng chất chống đông). Mỗi chuột tiêm 0,2 ml máu vào phúc mạc.
Theo dõi biểu hiện của chuột thí nghiệm sau tiêm truyền. Mỗi ngày kiểm tra máu chuột thí nghiệm 1 lần để phát hiện tiên mao trùng bằng phương pháp xem tươi.
3.4.3. Phương pháp thu thập định loại côn trùng môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
Chúng tôi theo dõi quy luật hoạt động của các loại côn trùng môi giới truyền bệnh tiên mao trùng theo từng thời điểm trong năm và trong ngày bao gồm: Tháng bắt đầu hoạt động, tháng hoạt động cao điểm và tháng nghỉ trong năm; giờ bắt đầu hoạt động, giờ hoạt động cao điểm và giờ nghỉ trong ngày. Nếu thấy sự xuất hiện của ruồi, mòng thì đánh dấu và sau khoảng thời gian điều tra tổng hợp quy luật hoạt động của ruồi, mòng và ký hiệu như sau:
(+): Hoạt động ít
(++): Hoạt động trung bình (+++): Hoạt động mạnh (-): Ngừng hoạt động
Phương pháp thu thập ruồi,mòng: Dùng vợt làm bằng vải thưa, miệng vợt bằng sắt có đường kinh 30 cm bắt ruồi, mòng ở những nơi như chuồng nuôi gia súc, bãi chăn thả, nơi làm việc và nghỉ ngơi của gia súc.
Phương pháp làm tiêu bản: Dùng vợt bắt ruồi, mòng và cho bay vào bình có chứa Kalicianua khoảng 10 – 20 phút. Khi ruồi, mòng chết đổ ra hộp giấy, dùng kim nhỏ 1 – 2 cắm qua thân từ trên xuống (1/3 phía trước, 2/3 phía sau); cắm kim vào xốp hoặc nút chai, sau đó chỉnh tư thế như chân, cánh....; phơi ra nắng (tránh gió). Mỗi tiêu bản ghi rõ địa chỉ, ngày
giờ bắt, loài gia súc hút máu....Những mòng hút nhiều máu, dùng kim trích rìa thân cho máu xẹp rồi làm mẫu tương tự như trên. Các mẫu được định loại theo cách định loại của (Trịnh Văn Thịnh, 1967) [25], (Phan Địch Lân, 1983) [12].
3.4.4. Một số quy định trong nghiên cứu đặc điểm dịch tễ
* Quy định về tuổi trâu
- Theo Trần Văn Tường (2000) thì căn cứ vào độ mòn của răng và việc thay răng để xác định tuổi trâu bò. Vì vậy chúng tôi phân tuổi trâu nghiên cứu ra theo 4 lứa tuổi:
+ Dưới 2 năm tuổi + 2 – 5 năm tuổi + 5 – 8 năm tuổi + Trên 8 năm tuổi
* Các tháng theo dõi trong năm
Chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu trong các tháng 6, 7, 8, 9, 10.
3.4.5. Xây dựng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng
- Để xác định hiệu lực của phác đồ điều trị, chúng tôi bố trí các thử nghiệm trên diện hẹp và trên thực địa. Sau đó lựa chọn một phác đồ tốt nhất để điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu ở địa phương.
- Xây dựng 3 phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng, mỗi phác đồ gồm có:
+ Thuốc diệt tiên mao trùng
+ Thuốc trợ tim, trợ lực cho con vật -Phác đồ I:
Adizin : 4,0 mg/ kgTT
Nước sinh lý mặn : 200 ml/ con
Cafein 20% : 15 ml/ con
Vitamin C 5% : 15 ml/ con
Vitamin B1 2,5% : 15 ml/ con
-Phác đồ II:
Trypamidium samorin : 1,2 mg/ kgTT Nước sinh lý mặn : 200 ml/ con Cafein 20% : 15 ml/ con Vitamin C 5% : 15 ml/ con Vitamin B1 2,5% : 15 ml/ con -Phác đồ III:
Diminavet : 4,0 mg/ kgTT
Nước sinh lý mặn : 200 ml/ con
Cafein 20% : 15 ml/ con